MALDI-TOF-MS在生物化学和高分子化学中的应用
季怡萍;孙淑清;刘志强;刘淑莹
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2001(020)0z1
【摘 要】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)这一先进技术是80年代末发展起来的一个质谱学分支,它的诞生无疑为国内诸多领域注入了一丝新鲜的活力.自从带基质的激光解吸电离飞行时间质谱技术问世以来,具有良好的"软电离"性质对杂质的包容性以及可直接分析混合物而无需预先分离等特点,已广泛地应用于生物化学、高分子化学、有机化学、金属有机化学、药学等领域,显示出独特的潜力和应用前景.本文讨论了MALDI-TOF-MS技术在生物化学和高分子化学领域中的应用.……
【总页数】2页(P153-154)
【作 者】季怡萍;孙淑清;刘志强;刘淑莹
【作者单位】中国科学院,长春应用化学研究所,吉林,长春,130022;中国科学院,长春应用化学研究所,吉林,长春,130022;中国科学院,长春应用化学研究所,吉林,长春,130022;中国科学院,长春应用化学研究所,吉林,长春,130022
【正文语种】中 文
【中图分类】O657-55
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基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273126，30972454，81102154）；深圳市重点实验室提升发展项目（CXB201005260068A）；广东省医学科研基金（（B2012322，A2013598））；深圳市科技计划项目［医疗卫生类（201202086）］作者简介：杨细飞（1978－），男，博士，副研究员，主要从事微生物学检验及神经科学研究。通讯作者：刘建军，E－mail：junii8@126．com·论著·MALDI－TOF－MS技术在细菌鉴定方面的应用研究
杨细飞，刘威，夏菠，任晓虎，黄新凤，刘建军深圳市疾病预防控制中心现代毒理学重点实验室，广东深圳518055摘要：目的探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix－AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI－TOF－MS）技术在细菌快速鉴定方面的实用性。方法将同一方法分离纯化后的20株试验菌株分别接种到营养肉汤中，37℃过夜培养后按照同一标准预处理。采用MALDI－TOF－MS检测和MALDIBiotyper软件分析数据，同时以16SrDNAPCＲ方法对细菌进行鉴定。结果20株试验菌株中成功鉴定了17株，鉴定率85%，并且与16SrDNAPCＲ鉴定结果基本一致，说明鉴定结果准确性较高。结论MALDI－TOF－MS方法鉴定细菌快速准确且操作简单，可发展为细菌鉴定的重要辅助工具。关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;16SrDNAPCＲ法;细菌;鉴定中图分类号：O657．63文献标识码：A文章编号：1004－8685（2014）08－1078－04ApplicationofMALDI－TOF－MStechnologyinbacteriaidentificationYANGXi－fei，LIUWei，XIABo，ＲENXiao－hu，HUANGXin－feng，LIUJian－junKeyLaboratoryofModernToxicology，ShenzhenCentreforDiseaseControlandPrevention，Shenzhen518055，ChinaAbstract：ObjectiveTodiscusstheutilityofmatrix－assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry（MALDI－TOF－MS）inrapididentificationofbacteria．MethodsTwentyteststrains，whichwereseparatedandpurifiedinthesameway，wereinoculatedtonutrientbroth，andcultivatedat37℃overnightbeforepretreatmentaccordingtothesamestandard．ThebacterialstrainswerethendetectedbyMALDI－TOF－MSandanalyzedbyMALDIBiotypersoftware．Atthesametime，16SrDNAPCＲwasalsoappliedasthecontrolmethod．ＲesultsSeventeenstrainsweresuccessfullyidentifiedfrom20teststrainswiththeidentificationrateof85%．TheresultsofMALDI－TOF－MSwerebasicallythesamewiththoseof16SrDNAPCＲassay，indicatingthehighveracityofMALDI－TOF－MS．ConclusionMALDI－TOF－MSwasaccurate，fastandeasy－operatedforbacteriaidentification，anditcouldbedevelopedasanimportantassistanttoolforbacteriaidentifica-tion．KeyWords：Matrix－assistedlaserdesorption/ionizationtime－of－lightmassspectrometry；16SrDNAPCＲassay；Bacteria；Identification细菌在日常生活中无处不在，既存在有利的一面，又影响人类的健康和安全。准确及时鉴别各种细菌，并监测其流行情况，对于及时提供治疗方案和控制感染极为重要。目前，细菌的鉴定技术主要包括建立在形态学、生态学、细胞生理学和生物化学水平上的经典方法和逐步发展成熟的分子生物学方法。经典生化鉴定方法虽然具有权威性，但存在操作繁琐、检测周期长等缺陷。分子生物学方法将细菌鉴定引入核酸和蛋白质等大分子水平，具有重大意义。但仍存在某些不足，不能满足快速准确、高通量鉴定的需求。基于MALDI－TOF－MS的MALDIBiotyper高通量微生物鉴定系统可以满足微生物的快速、准确鉴定与分类的需求，并且操作方法简单、快速、高通量［1，2］。其基本原理是：被测样品以一定比例与基质化合物溶液相混合，使所测分子以单分子状态分散在基质中。干燥后用脉冲激光照射基质，基质因吸收能量而激发，并使所测分子链被逐出并离子化。这一过程并不导致分子链断裂，通常只生成分子离子及其多聚体。离子化后的分子在时间飞行质谱仪中被加速并被检测，被测分子按质量数的大小进行分离。通过与数据库信息比对，筛选并确定相应图谱，进而得到鉴定结果，从而实现对不同细菌属、种、亚种的区分和鉴定［3］。1996年首次报道MALDI－TOF－MS应用于细菌的快速鉴定［4］。之后，MALDI－TOF－MS又成功用于食品和环境中真菌和细菌的检测［5，6］。本实验室使用同一方法获得分离纯化后的菌株20株，利用MALDI－TOF－MS技术进行检测和鉴定，同时与16S·8701·中国卫生检验杂志2014年4月第24卷第8期ChinJHealthLabTec，Apr2014，Vol24，No8rDNAPCＲ传统鉴定法进行比较。1材料与方法1．1仪器基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱（UltrafleXtremeMALDI－TOF/TOFMS，美国Bruker公司）；离心机（美国BeckmanCoulter公司）；超纯水仪（美国Millipore公司）。测序级α－氰基－4－羟基肉桂酸（α－cyano－4－hydroxycinnamicacid，CHCA）和标准品（购自美国Bruker公司）。用50%乙腈（Acetonitrile，ACN）（含2．5%三氟乙酸（Trifluoro-aceticacid，TFA））配制饱和的CHCA，即100%ACN∶H2O∶10%TFA比例为2∶1∶1。在多肽标准品管（Peptidestandard）中加入500μl50%ACN（含0．1%TFA），配成终浓度为1pmol/μl；在蛋白I标准品管（ProteinstandardI）中加入125μl50%ACN（含0．1%TFA），配成终浓度为4pmol/μl；取上述两种标准品等体积混匀即为校准品。每20μl一管分装，－20℃冰箱中保存备用。1．2试剂测序级α－氰基－4－羟基肉桂酸（α－cyano－4－hydroxycinnamicacid，CHCA）和标准品（购自美国Bruker公司）；50%乙腈（Acetonitrile，ACN）。1．3方法1．3．1细菌培养基根据要求取定量培养基粉末加入水中，并添加1%～2%的琼脂粉（根据琼脂凝固程度决定）；加热至100℃溶化后，趁热调整pH为7．4；分装于试管或三角烧瓶中，塞好试管和瓶塞，包装好后121℃灭菌15min～30min；待培养基冷至50℃左右时无菌操作倒入无菌试管，趁热将试管斜置，冷凝后即为琼脂斜面培养基；将培养基倒入无菌平皿，平放，待凝固后即为普通琼脂平板。置4℃冰箱中保存备用。琼脂斜面培养基主要用于纯种细菌的培养，琼脂（琼脂血）平板主要用于杂种细菌的分离等。1．3．2细菌分离纯化通过各种途径获得微生物后，将其制备成微生物悬液，然后把微生物悬液经过适当稀释，取一定量的稀释液放在无菌固体营养琼脂平板上，用无菌三角玻璃刮铲把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经37℃恒温培养24h后得到有多个单菌落的平板。用无菌接种环挑取典型单菌落在新的营养琼脂平板上进行划线后于37℃恒温培养24h，待菌落形成后再重复划线分离培养，以确保获得的是单一的细菌。直接对分离纯化后的菌株进行检测，或将其接种到试管斜面上进行培养，待菌落形成后，于4℃中保存。1．3．3菌株活化将试验菌株分别接种到营养肉汤中，37℃培养过夜。通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。1．3．416SrDNAPCＲ鉴定首先用酚－氯仿提取法提取细菌的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，通用引物为扩增引物进行PCＲ以扩增16SrDNA。反应完毕，经过琼脂糖凝胶电泳确认目的片段后，将PCＲ扩增产物送上海生工进行测序。将序列提交GenBank数据库，通过BLAST进行同源搜索，寻找与目的序列同源性最高的已知分类地位菌种的16SrDNA，确定细菌的种类。1．3．5质谱鉴定样品前处理⑴固定灭活：先在1．5mlEP管中加入300μl纯净水，做好标记。用无菌枪头从琼脂平板上挑取适量（5mg～10mg）单菌落样品，仔细混匀，再加入900μl无水乙醇，仔细混匀（这样处理后样品可在－20°C保存几周）；高速离心2min（10000rpm），轻轻倒掉上清，再离心一次，尽量去除乙醇；⑵蛋白溶出：加入50μl70%甲酸，仔细混匀，再加入50μl乙腈，仔细混匀，高速离心2min，吸取上清于另一干净的0．5mlEP管中。1．3．6MALDI－TOF－MS检测先在不同位置分别点1μl上清（1个样品点3个重复）和校准品，放干后再点1μl基质，室温晾干后准备MALDI－TOF－MS检测。标准品校准：⑴打开flexControlVersion3．0（Build85）软件，选择LP_BioTyper．par方法；⑵设置参数：355nmSmartbeam激光；延迟提取时间（Delayextractiontime）：300ns；采集范围选择为1kDa～20kDa；⑶点击Calibration在MassControllist中选ClinprotStandard校准方法，并将Mode选为Quadratic模式；⑷观察结晶情况，打靶（start），观察信噪比、信号强度、分辨率，校准好标准品。采集细菌样品的质谱数据：试点几个样品，看看效果以便设置自动打靶：⑴点击AutoXecute在Method中选择样品测量方法———AutoBiotyper；⑵按Edit设定激光能量、分辨率、累计数、累加方法、靶位移动等参数并保存，主要参数如下：45%初始激光能量；600的分辨率；每个点100个shots，累加10个不同位置，每一个样品点共得到1000个shots；⑶编辑待测样品自动打靶的位置，保存后按StartAutomaticＲun开始自动测量。1．3．7BioTyper鉴定首先打开flexAnalysisVersion3．0（Build74）软件，对图谱作前期修饰性处理———平滑和砍基线，观察重复性和稳定性；然后打开MALDIBioTyperVersion2．0SＲ1（Build223．8）软件，选择细菌数据库：CellularOrganisms（Archaea、Bacteria、Eu-karyota），根据自己菌种情况选择菜单命令Identifica-tion/startidentification进行鉴定；选择菜单命令Ｒe-port/showreport，显示鉴定报告；选择菜单命令File/saveas把报告存到文件目录。同一菌株重复3次MALDI－TOF－MS检测，以判断该方法的重复性和稳定性。2结果2．1Biotyper分析软件判定标准通过Biotyper软·9701·中国卫生检验杂志2014年4月第24卷第8期ChinJHealthLabTec，Apr2014，Vol24，No8
基质辅助激光解吸电离质谱技术
基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-TOF）是一种分析生物分子的强大工具。它已经在蛋白质、核酸和其他生物分子分析方面得到广泛应用。下面将从以下四个方面介绍MALDI-TOF技术的原理、优点和应用。
一、原理
MALDI-TOF技术基于激光的原理，将样品与基质的混合物直接离子化，负离子和正离子由离子源加速器加速并分离，形成离子束，然后质量分析器通过测量离子的飞行时间确定其质量。该技术的核心基质辅助激光解吸（MALDI）利用吸收激光能量的基质辅助离子化样品，以便于其在质谱仪中分析。
二、优点
1.高灵敏度和快速分析速度
2.允许复杂混合物的分析
3.适合大分子分析
4.样品制备简单，并且适合高通量分析
三、应用
1.蛋白质质量分析
MALDI-TOF技术被广泛用于蛋白质质量分析，如蛋白质组学研究、酶学、蛋白质结构与功能研究等领域。
2.核酸分析 MALDI-TOF技术已用于分析DNA序列，RNA序列、突变筛查等应用。
3.药物筛选
MALDI-TOF技术可以被用于药物筛选研究，例如药物的质量控制和药物代谢动力学等。
4.食品安全
MALDI-TOF技术可以基于蛋白质和碳水化合物分析技术来鉴定、检测和鉴别食品中的致病菌和其他食品中的杂质。
四、结论
MALDI-TOF是一种革命性分析技术，已被广泛应用于多个领域，包括蛋白质质量分析、核酸分析、药物筛选和食品安全等。由于它的快速、高灵敏度和不依赖于基础知识的可靠性，它被证明是高通量分析的方法选择之一。
MALDI- TOF介绍
MALDI- TOF的特点及其应用领域
基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI- TOF)工作原理是：将样品与能强烈吸收激光的基质配成溶液，溶剂挥发后形成的“固体溶体” 进入离子源，激光照射“固体溶体” ，基质吸收能量并传递给样品形成离子，样品离子进入飞行时间质谱仪中进行检测。
MALDI- TOF能在短时间内迅速发展，归结于它具有如下特点：(1) 质量检测范围宽(已超过300KD a);(2) 质量的准确度高(达0.01%);(3) 灵敏度(尤其是全质量范围灵敏度) 高， 样品量只需1pmol 甚至更少；(4) 对样品要求很低，能忍耐较高浓度的盐，缓冲剂和非挥发性杂质；(5) 分析速度快，分子离子峰强，信息直观。
由于MALDI- TOF的上述优点，MALDI- TOF在测定大分子化合物，尤其是蛋白，核酸，多糖，脂类等生物大分子上是其他质谱所无法代替的。在蛋白质组学研究，基因组研究以及生物天然药物的开发等领域起到了重要的作用。进几年来，又在分析有机小分子，有机金属簇化合物，低聚物，元素高分子，光电材料，缩聚反应等上取得重大进展，已逐步发展成为现代化学分析中一项普通实用的，快速高效的检测手段。
1 在蛋白质及蛋白质组学等生命科学研究中的应用
MALDI- TOF在多肽和蛋白的分析领域，相对来说已比较成熟，用胰蛋白酶或羧肽 酶Y酶解，通过测肽指纹图谱(PMF) 鉴定蛋白，或者通过利用MALDI离子源特有的能生成亚稳态离子，可发生源后裂解(PSD，post source decay) 分析多肽的氨基酸序列，并已有许多成功的例子。
核酸的分析最近取得重要的进展，用Er.YAG激光器(2.94um) 及甘油为基质可观测到含2180个碱基对的DNA的准分子峰，所需样品量为fmol水平。因此，MALDI-
TOF也可用于基因组研究中遗传多样性的分析。
2 在高分子材料研究中的应用 目前，在分析合成高分子的手段中，质谱越来越表现出它的重要性。用MALDI-
