一次性微量二恶英(TCDD)摄取对青鳉幼鱼脊椎发育的影响

■词斟安呈　

一次性微量二恶英（ＴＣＤＤ）摄取　

对青鲻幼鱼脊椎发育的影响　

于永利ｈ。，魏素香。，董　武　２　。№ｓ　￣ＲＥ　ＡＬ　ＩＮＤ　ＵＳ＂＋ＦＹ　鞋　＆　牲Ｏ　１、　—再　

（１．内蒙古民族大学动物科技学院∥内蒙古自治区高等学校毒物与动物疾病监控重点实验室，内蒙古通辽０２８０４２；２．内蒙　古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽０２８０４２；３．Ｂｉｏ－一Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．．，一ＤＮＡ　Ｌａｂ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ　Ｔｅｘａｓ　７５０５７）　

摘　要：二恶英（ＴＣＤＤ）是一种持久性环境污染物质，它的高残留性、致畸性已经引起世界各国的重视。以青鲋胚　

胎作为试验动物模型，从分子水平探讨了ＴＣＤＤ对青鲋胚胎脊椎的毒性作用机制。结果表明：ＴＣＤＤ造成青鲋幼　

鱼脊椎生成障碍，脊椎生成数目与ＴＣＤＤ染毒浓度呈负相关。ＴＣＤＤ引起青鲋胚胎软骨发育的变化与Ｓｏｘ９ｂ的　

表达降低密切相关。　

关键词：二恶英；青鲋胚胎；脊椎；软骨发育　

中图分类号：￥９６５．１；￥８１６．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００３—６２０２（２０１３）０３—００３８—０３　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｒａｃｅ　ｄｉｏｘｉｎ（ＴＣＤＤ）ｕｐｔａｋｅ　ｏｎ　ｍ￣ａｋａ　ｊｕｖｅｎｉｌｅ　ｓｐｉｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｙｕ　Ｙｏｎｇｌｉ１　，Ｗｅｉ　Ｓｕｘｉａｎｇ。，Ｄｏｎｇ　Ｗｕ　

１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ　ｆ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｔｏｘｉｃａｎｔｓ　ａｎｄ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ　０２８０４２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ—　ｅｎｃｅｓ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｔｏｎｇｌｉａｏ　０２８０４２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｂｉｏ‘－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．，一ＤＮＡ　Ｌａｂ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，　

Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ　Ｔｅｘａｓ　７５０５７，ＵＳＡ）　ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ　ｄｉｏｘｉｎ（ＴＣＤＤ）ｉｓ　ａ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ，ｉｔｓ　ｈｉｇｈ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ａｎｄ　ｔｅｒａｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｈａｓ　ａｔｔｒａｃｔｅｄ　ｇｒｅａｔ　ａｔｔｅｎｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗｏｒｌｄ．Ｕｓｉｎｇ　ｍｅｄａｋａ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｎｉｍａｌ　ｍｏｄｅｌ，ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ＴＣＤＤ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｎ　ｍｅｄａｋａ　ａｍ—　

ｂｒｙｏ　ｓｐｉｎｅ　ｗａｓ　ｅｘｐｌｏｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌｅｖｅＬ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ：ＴＣＤＤ　ｃａｕｓｅｄ　ａ　ｍｅｄａｋａ　ｊｕｖｅｎｉｌｅ　ｓｐｉｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｄｉｓｏｒ—　

ｄｅｒ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｐｉｎｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｗａｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＴＣＤＤ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．ＴＣＤＤ　ａｌｓｏ　ｃａｕｓｅｄ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｃａｒｔｉ—　ｌａｇｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　ｍｅｄａｋａ．ａｎｄ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｏｘ９ｈ．　

ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ＴＣＤＤ；ｍｅｄａｋａ　ｅｍｂｒｙｏｓ；ｓｐｉｎｅ；ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｄｅｖｅｋ￣ｐｍｅｎｔ　

随着我国经济的发展，人民与国家对食品安全　的要求也逐步提高，这也是与世界接轨的必然要求。　

食品与动物饲料中微量环境污染物质——二恶英的　

残存与污染，已引起研究者与监管部门的重视。尤　

其是二恶英的短时间微量摄人，或一次性暴露接触　

的毒性安全更有待于评价与试验。　

二恶英是一类具有高残留性、高生物浓缩性和　

高生物毒性的持久性有机污染物（Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　Ｏｒ—　

ｇａｎｉｃ　Ｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ，简称ＰＯＰｓ）。它广泛分布在我们　生活的环境中，主要的来源是垃圾的不完全燃烧（特　

别是中小型焚烧炉）和农药生产中所产生的副产品；　

另外，氯碱的生产过程也是一些地区环境污染的来　源之一［１］。排放到大气环境中的二恶英可以吸附在　

颗粒物上，沉降到水体和土壤，然后通过食物链的富　

集作用进入人体。目前我国对ＰＯＰｓ的研究越来越　

重视，人们对二恶英类物质危害的意识也不断加强，　

预想我国对二恶英类为主的持久性环境有机污染物　

质的评价标准也将逐步提高。但国内对二恶英的研　究仅限于极其狭窄的领域和范围，尚未形成体系，还　

有待于进一步加强，尤其是二恶英对有机体的毒性　

作用机制，污染评价体系以及我国污染状况的调查　

迫切需要进一步深入研究。　

二恶英中最具有典型性的２，３，７，８一四氯一二苯　

基一对一二恶英（２，３，７，８一ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｃｄｉｂｅｎｚｏ－ｐ－ｄｉｏｘｉｎ，简　

收稿日期：２０１３—０１—１５；修回日期：２０１３－－０３一Ｏ１　基金项目：国家自然科学基金项目（３０３６００９０，２１２６７０１５）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（ＮＣＥＴ—Ｏ４—０２６２）　内蒙古自治区自然科学基金（２０１２ＭＳ１２０３）　作者简介：于永利（１９７８一），男，讲师，硕士，主要从事农药、饲料安全性评价及食品毒理学研究工作。　通讯作者：董武（１９６９一），男，教授，博士，硕士生导师，主要从事环境毒理学研究工作。

　于永利等：一次性微量二恶英（ＴＣＤＤ）摄取对青鲔幼鱼脊椎发育的影１１￣／２０１３年囊３期　

称ＴＣＤＤ）引起小鼠上腭的开裂，血液循环系统障碍　

的典型症状，已经广为人知。Ｘｉｏｎｇ等发现ＴＣＤＤ引　起下颌短小与ＳＲＹ－ｂｏｘ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｇｅｎｅ　９（Ｓｏｘ９）基　

因相关联　］。Ｓｏｘ９是对软骨发育有决定性作用的一　

个基因，尤其是对早期胚胎的软骨分化与发育有着　重要的作用＿３。］。青锵（Ｏｒｙｚｉａｓ　ｌａｔｉｐｅｓ）的Ｓｏｘ９有两　

个分型，即Ｓｏｘ９ａ和Ｓｏｘ９ｂ，其中Ｓｏｘ９ｂ对软骨的发育　

更为重要。但有关ＴＣＤＤ引起骨骼发育障碍还不是　

很清晰，具体机制也有待进一步研究。　在小型鱼类中，青锵（Ｏｒｙｚｉａｓ　ｌａｔｉｐｅｓ）对二恶　英类环境毒物的反应比斑马鱼更为敏感＿５］。青鳝　

具有以下显著的特点：基因组分析完毕，饲养容易，　

早期身体透明，可利用转基因青鳝较多等等。本试　

验使用低浓度ＴＣＤＤ，短时间（１　ｈ）一次性暴露染　

毒，模拟人类可能接触二恶英造成的影响，初步观察　

到ＴＣＤＤ对青锵脊椎软骨发育的特异性影响，并且　研究了与其关联基因Ｓｏｘ９ｂ表达的变化。　

１材料和方法　

１．１　试验药物　

２，３，７，８一四氯一二苯基一对一二恶英（ＴＣＤＤ）来自　

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｉｓｏｔｏｐｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ），　

纯度大于等于９８　。钙黄绿素（Ｃａｌｃｅｉｎ）等购自　Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。抗地高辛抗体（ＤＩＧ抗　

体）等购自Ｒｏｃｈ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。　

１．２试验动物及染毒方式　

受精卵根据文献［６］的方法，将青鳝雌、雄分别　培养，并以雌：雄一１４：１０光周期促熟，试验前一　

天混养。受精后４　ｈ开始染毒，染毒时使用３　ｃｍ培　

养孤，二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）作为助溶剂，采用质量　浓度为０．１×ｌＯ　、０．３×１０　ｋｇ／ｍ。ＴＣＤＤ染毒，　

定容到３　ｍｌ，每个培养皿放入１Ｏ个受精卵，置于　

２８．５℃孵化箱内续孵化。青鳝胚胎进行ＴＣＤＤ染　

毒１　ｈ后使用培养液清洗，然后将青锵胚胎放在培　养皿中固定用于以下各种试验。　

１．３钙黄绿素染色　

钙黄绿素（Ｃａｌｃｅｉｎ）染色根据文献Ｅ７］方法进　

行。取ｏ．０２　ｇ的钙黄绿素溶解在ｌＯ　ｍｌ去离子消　毒水中，然后加入ｏ．５　ｍｌ／Ｌ　ＮａＯＨ中和钙黄绿素　

的酸性。取发育１０　ｄ的青鳝胚胎放在以上溶液中　

染色１０　ｍｉｎ后再放在清水中清洗５次，最后使用绿　

色荧光显微镜进行拍照、计数与分析观察。　

１．４原位杂交　

发育４　ｈ的青鳝胚胎，经ＴＣＤＤ或者ＤＭＳＯ处　

理１　ｈ后清洗，培育至８　ｄ，或者１０　ｄ后使用体积分　

数为１Ｏ　中性缓冲福尔马林溶液固定（过夜），然后　圈　

用磷酸缓冲液清洗后放在体积分数１００　甲醇中备　

用。青鳝胚胎使用蛋白酶Ｋ室温消化，加入杂交液　

后在温度６５℃的恒温箱中预杂交１　ｈ，然后用含有　

Ｓｏｘ９ｂ探针的杂交缓冲液更换，放于恒温箱中过　

夜；次日清洗，加入抗地高辛抗体（３　０００倍稀释），　

在温度４℃冰箱中反应过夜，再清洗后显色摄影。　

１．５统计方法　试验数据用ＳＰＳＳ统计软件进行单因素方差分　

析方法进行多重比较，用“平均值±标准误差”表　

示，差异显著性水平设置为“Ｐ＜０．０５”。　

２结果与分析　

２．１　ＴＣＤＤ引起青鲋幼鱼脊椎形成障碍　

青锵胚胎发育至４　ｈ，用０、０．１×１Ｏ　和０．３×　

１０　。ｋｇ／ｍ。ＴＣＤＤ对青鳝胚胎进行连续染毒１　ｈ，　

然后转移到正常的青鲔胚胎培养液中。其中一部分　

青鳝胚胎培育到１０　ｄ，进行软骨染色（Ｃａｌｃｉｅｎ染　

色）；另一部分青锵胚胎培育到８　ｄ，实施原位杂交。　

青锵胚胎发育至１０　ｄ，各组之间的死亡率与对　

照组（Ａ组）没有差异；但通过软骨染色发现，无论是　

低浓度的０．１×１０　。ｋｇ／ｍ。ＴＣＤＤ染毒组（Ｂ组），　

还是高浓度的０．３×１０一　ｋｇ／ｍ。ＴＣＤＤ染毒组（Ｃ　

组），青锵幼鱼初期脊椎数目均减少，结果见图１、　

图２。　

注：箭头表示发育过程中的脊椎。　ＴＣＤＤ对青鲔幼鱼脊椎发育的影响　

Ａ组　Ｂ组　Ｃ组　注：图中小字英文字母相同表示差异不显著（Ｐ＞Ｏ．０５），　字母不同表示差异显著（Ｐ＜Ｏ．０５）。　图２　ＴＣＤＤ对青鸯ｌ奇幼鱼脊椎发育的影响的定量分析　如图２所示，使用钙黄绿素染色得出各组脊椎　ｌ　０

图