超氧化物歧化酶活性的测定

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定氮蓝四唑法一、原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：o 2.-+H O 222+O H ＋反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。

而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。

据此可计算出酶活性的大小。

二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx)(三)试剂(1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。

(2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。

(3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。

(4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。

(5)20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定溶到1000mL ，避光保存。

三、试验步骤(一)酶液的提取(1)称取植物材料(去叶脉)0.2g ，加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使体积为5mL。

取2mL于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片。

（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支，黑色硬纸套。

（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

[0.2M的Na2HPO491.5mL和NaH2PO48.5mL混合后稀释4倍]or[0.05mol/L PBS缓冲液（pH7.8）：7.1g/L ，6.8g/LKH2PO4，按体积9:1混合，如pH高或低于7.8，则用KH2PO4或Na2HPO4调节。

每1000mL缓冲液含8gNaCl，0.2gKCl] 提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（4）100µmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。

（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存，现用现配。

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。

自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。

迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。

藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。

为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。

超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。

其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。

在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。

其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。

化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。

- · O2 -· O 2 + + 2H + H 2O 2 + O 2 SOD 玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定一、目的1．通过对玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。

2．掌握测定超氧化物歧化酶（SOD ）的活力和比活力的方法。

3．掌握分级盐析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。

二、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，简称SOD ），它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD ，Mn-SOD ，Fe-SOD 。

SOD 催化如下反应：在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症，如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，对生物体有保护作用。

在玉米中，SOD 主要存在于胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD 就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40%（NH 4）2SO 4去除杂蛋白部分，再用90%（NH 4）2SO 4饱和上清液，经过一定时间后，再将盐析液离心，取其沉淀进行透析，一定时间后，则其中的SOD 成分即被浓缩分离。

超滤也是一种蛋白质浓缩方法，其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜，并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。

利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD 与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD 浓缩液。

SOD 活性的测定：采用NBT 光还原法。

其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O 2-，当加入NBT 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），既而还原成二甲月替（呈兰色）。

该产物在560nm 下有最大吸收峰。

当加入SOD 时，可以使超氧自由基与H +结合生成H 2O 2+O 2，从而抑制了NBT 光还原的进行，使兰色二甲月替 生成速度减慢。

植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法【实验目的】1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。

2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。

【实验原理】超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。

SOD 是含金属辅基的酶。

高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。

SOD 能够清除超氧阴离子自由基 （O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。

超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。

生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ：2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。

本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。

被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。

当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大光吸收。

当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。

于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。

抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。

常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。

【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱（光照度为4000lx ）、容量瓶（10ml ）、试管2. 实验试剂50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液； 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液； 100μmol/L EDTA- Na 2溶液；CATSOD20μmol/L 核黄素溶液；SOD 提取介质：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）内含1% PVP 。

氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力一、 目的与要求SOD 在植物抗逆过程中发挥着重要的作用，通过本实验理解其抗逆机理，熟悉其操作步骤及其计算方法。

二、原理SOD 是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。

而SOD 可清除O 2-，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活力单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。

222222SOD O H H O O -+−−−→+222222CAT H O H O O −−−→+三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx ）；5.试管（三）试剂：1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na 2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH 2P048.5 ml ）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9397gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml ；3. 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，避光保存；4. 100μmol/L EDTA －Na 2溶液：称取0.03721gEDTA －Na 2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。

四、实验步骤1. 酶液提取：取叶片0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 预冷的PH 7.8的磷酸缓冲液，在研钵上研磨成匀浆，加缓冲液使终体积为10ml ，取5ml 于4度下4000rpm 离心15min ，上清液即为SOD 粗提液。

超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。

5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。

%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。

活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。

样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。

超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，它能够将有害的超氧自由基（superoxide radical, O2•⁻）转化为氧和过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2），从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。

因此，超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。

超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种，以下主要介绍两种常用的方法：一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，用发生超氧自由基的化学反应（如PMS-NADH系统）制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成，观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率，通过计算算出SOD活性。

步骤：1、准备试剂：PMS（N-甲基-苯肼）溶液、NADH（辅酶Ⅰ）溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。

2、制定反应液：取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中，使最终浓度分别为100μM和780μM，混匀。

3、制备样品：用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释，并在4℃下保存备用。

4、制备标准品：以SOD标准品（0-10U/mL）为浓度系列，每组分别加入50μL的样品和反应液，在37℃水浴中反应30min。

5、反应终止：以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。

6、测定吸光度：用紫外分光光度计测定反应液的吸光度，波长设置在340 nm。

7、计算超氧化物歧化酶活性：计算标准品的反应速率（Vx）和酶反应的反应速率（Vt），按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性：SOD活性（U/mL）=（Vt–Vx）/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，将超氧自由基产生物质注入试管中，随着时间的推移，样品中的超氧自由基将越来越少。

超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。

1、制备反应液：将样品加入含有相应浓度的降解剂中，使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。

胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。

参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。

邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。

单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。

这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。

近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。

过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。

生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。

植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。

抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。

SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。

二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。

如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。

H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。

超氧化物歧化酶测活超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是一种重要的酶类，它在生物体中发挥着重要的抗氧化作用。

抗氧化作用是指抑制或延缓氧化反应的过程，而氧化反应是导致许多疾病和衰老的主要原因之一。

超氧化物歧化酶能够将有害的超氧自由基（superoxide radical）转化为无害的氧气和过氧化氢（hydrogen peroxide），从而保护细胞免受氧化损伤。

超氧自由基是一种具有高度活性的氧化物质，它会与细胞中的DNA、蛋白质和脂质等生物分子结合，导致它们的功能受损甚至失去功能。

超氧化物歧化酶的存在能够有效地清除超氧自由基，维持细胞内氧化还原平衡，保护细胞的正常功能。

超氧化物歧化酶在生物体内广泛存在，包括细菌、植物和动物等。

不同种类的超氧化物歧化酶在结构上存在一定的差异，但它们都具有相似的催化机制。

超氧化物歧化酶通常由两个亚单位组成，其中一个亚单位含有金属离子，如铜、锌或镁等，而另一个亚单位则不含金属离子。

这两个亚单位之间通过氧桥（oxygen bridge）相互作用，形成稳定的酶分子。

超氧化物歧化酶的活性可以通过测定其催化反应的速率来确定。

常用的测定方法是利用超氧自由基与氨基乙基化蓝（nitroblue tetrazolium，NBT）的催化反应。

超氧自由基能够将NBT还原为蓝色的形式，而超氧化物歧化酶能够降低这种还原反应的速率。

通过测定反应体系中蓝色的强度变化，可以计算出超氧化物歧化酶的活性。

超氧化物歧化酶的活性受多种因素的影响，包括温度、pH值、金属离子浓度和抑制剂等。

一般来说，超氧化物歧化酶的活性随着温度的升高而增加，但在高温下会发生失活。

pH值的变化也会对超氧化物歧化酶的活性产生影响，不同种类的超氧化物歧化酶对pH值的适应范围不同。

金属离子的存在可以增强超氧化物歧化酶的催化活性，而一些抑制剂则可以抑制其活性。

超氧化物歧化酶的测活方法不仅在科学研究中起着重要作用，也在医学诊断和药物开发中有广泛的应用。

高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1 超氧化物歧化酶（SOD ）活性和丙二醛含量的测定（操作步骤）1 试剂配制1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制注：配成PBS2000ml ，其中1000ml 用于A 液配制，另1000ml 用于酶液制备。

1.2 其它溶液配制2 酶液制备称取植物材料１g ，加少许0.05mol/L 、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10 ml 匀浆。

转移至10ml 离心试管中，在3000 rpm 下粗离心１分钟，粗提液再转移至2个5ml 离心管中，在冷冻离心机13000g 、４℃下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD 活性和丙二醛含量的测定。

3 丙二醛含量测定吸取酶液２ml →加入Ｆ液２ml →沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm 下离心５分钟。

若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。

以Ｆ液为参比液，分别在532nm 和600nm 处测定光密度值。

丙二醛含量（nmol ·g -1）＝式中：V/v --- 提取液总量(10ml)／测定液用量(2ml)R --- 反应液总量(４ml)Ｗ --- 植物材料鲜重或干重(g)0.155 --- 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml 时,OD 532-OD 600=0.155)[即( OD532—OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml ]室温下处理的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值室温下丙二醛含量（nmol·g-1）=-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75 nmol·g-1 冷处理下的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值冷处理下丙二醛含量（nmol·g-1）=0.077-0.026/0.155×4×10/2×1=6.58 nmol·g-14 超氧化物歧化酶活性测定4.1 操作及说明* 仪器调零液中的“酶液”0.1ml，可以取对照植株的，也可以取胁迫植株的。

植物组织中超氧化物歧化酶活性测定植物组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定是一项重要的生物化学实验，它有助于了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。

以下是测定植物组织中超氧化物歧化酶活性的实验步骤和注意事项。

一、实验材料1.实验植物：选择新鲜、健康的植物组织，如叶片、根或茎。

2.实验试剂：包括磷酸缓冲液（pH 7.8）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氮蓝四唑（NBT）、核黄素、酶提取液等。

3.实验设备：包括分光光度计、离心机、研钵、试管、滴定管等。

二、实验步骤1.酶提取：将植物组织研碎，加入适量的酶提取液，充分研磨并混合均匀，然后置于离心机中以3000-4000 r/min的速度离心10-15分钟，得到清亮的上清液。

2.酶活性测定：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）、0.1毫升的核黄素和0.002毫升的酶提取液，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。

3.空白对照：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）和0.1毫升的核黄素，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。

4.数据记录：记录酶活性测定和空白对照的吸光度值，并计算超氧化物歧化酶活性。

三、注意事项1.实验过程中要保证所用试剂的纯度和新鲜度，避免影响实验结果。

2.离心机使用前应预热，保证离心的效果和效率。

3.在酶活性测定中，加入酶提取液时应十分小心，避免产生气泡，影响吸光度的测定。

4.在整个实验过程中要保证温度、光照等环境因素的一致性，以减小误差。

5.在数据处理时，应按照公式计算超氧化物歧化酶活性，并进行统计分析和比较。

四、结果分析通过对实验数据的分析，可以得出不同植物组织中超氧化物歧化酶活性的大小及其变化规律。

这些数据可以帮助我们了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。

例如，当植物受到逆境条件的影响时，超氧化物歧化酶的活性可能会发生变化，通过比较不同植物组织的超氧化物歧化酶活性，可以筛选出抗逆性较强的植物品种，为农业生产提供参考。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定一、原理将25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%所需的SOD定义为一个活力单位。

在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据SOD抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD活力。

二、试剂1、A液：PH8.20 0.1mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（内含1mmol/LEDTA·2Na）。

称取1.2114g三羟甲基氨基甲烷和37.2mgEDTA·2Na溶于62.4ml0.1mol/l盐酸溶液中，用蒸馏水定溶至100ml。

2、B液：4.5mmol/l邻苯三酚盐酸溶液。

称取邻苯三酚56.7mg溶于少量10mmol/l盐酸溶液，并定容至100ml。

3、盐酸溶液：10mmol/l4、蒸馏水：二重石英蒸馏水。

三、仪器1、紫外-可见分光光度计；2、精密酸度计，0.01PH；3、离心机；4、10ml比色管；5、10ml离心管；6、玻璃乳钵。

四、测定步骤1、植物超氧化物歧化酶样品1.00g置于研钵中，加入9.0ml蒸馏水研磨5分钟，移入10ml 离心管。

用少量蒸馏水冲洗研钵，洗液并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经4000r/min离心15分钟，取上清液测定。

2、在25℃左右，于10ml比色管中依次加入A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml。

加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1Min后吸光度值，二者之差为邻苯三酚自氧化速率△A325（min-1）为0.060。

3、在25℃左右，于10ml比色管中依次加入20.0ul样液或酶液，A液2.35ml，蒸馏水2.00ml，B液0.15ml。

加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1分钟后吸光度值，二者之差为样液或酶液抑制邻苯三酚自氧化速率△A′325（min-1）。

加入样液或酶液的量使抑制邻苯三酚自氧化速率为1/2△A′325（min-1），即0.030。