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超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。
超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。
（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2. 仪器荧光灯管。
离心机。
分光光度计。
pH计。
3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为 1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
SOD_测定方法SOD（Superoxide Dismutase）是一种重要的抗氧化酶，它可以将有害的超氧自由基转化为氧和过氧化氢，从而保护细胞免受氧化损伤。
SOD的测定方法有多种，下面将介绍常用的几种方法。
1.超氧根自由基抑制法：该方法通过测定SOD对超氧自由基的抑制能力来测定SOD的活性。
超氧根自由基在存在特定底物的条件下，可以引起化学反应的颜色变化，通过测量这种变化的幅度可以得出样品中SOD的活性。
超氧根自由基抑制法具有可操作性强、结果可靠的特点，是常用的SOD活性测定方法之一2.X射线法：该方法利用X射线产生的自由基对辅酶A的氧化程度来测定SOD活性。
辅酶A在被氧化前后，有很大的吸收差别，可以通过比较吸收光谱来计算SOD活性。
3.含氮蓝法：含氮蓝为特定底物，可以在碱性条件下与还原型NBT（硝基蓝）产生紫色的还原型NBT。
SOD能够阻止NBT的还原反应，因此通过测量样品和对照组在一定时间内的吸光度差值，可以计算出SOD的活性。
4.电化学法：该方法利用电化学生物传感器对SOD的电化学反应进行测定。
在电极表面，SOD催化还原型O2为H2O2，而H2O2又在电极表面电催化为电流。
通过测量电流的大小，可以得出样品中SOD的活性。
这些方法各有优缺点，选择合适的测定方法应根据实验条件和目的来确定。
无论采用何种方法，都需要严格控制实验条件，如温度、时间、pH 值等，以确保测定结果的准确性和可重复性。
鉴于SOD活性在不同组织和物种之间有所差异，建议在研究中同时采用多个测定方法进行验证，以获得更可靠的结果。
超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA检测试剂应用方法小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA检测试剂说明书检测原理试剂盒采纳双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被超氧化物歧化酶（SOD）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最后的黄色。
颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品活性。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避开任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞快速当心地分别。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：假如样本收集后不适时检测，请按一次用量分装，冻存于20℃，避开反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.510uL、220uL、20200uL、2001000uL3.37℃恒温箱操作注意事项试剂盒保存在28℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。
试验中不用的板条应立刻放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对比或者空白；依照说明书操作时样本已经稀释5倍，最结束果乘以5才是样本实际浓度。
严格依照说明书中标明的时间、加液量及次序进行温育操作。
全部液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒构成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无停止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0S5）浓度依次为：0、20、40、80、160、320U/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
人超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。
用纯化的总SOD 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP标记的超氧化物歧化酶（SOD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人超氧化物歧化酶（SOD）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：540ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。
分别用蒸馏水定容到1000ml。
L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。
参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。
（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。
（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。
（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取NBT用PBS定容至100ml，避光保存。
酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。
2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。
（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。
（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法-（2154）抗氧化酶（ SOD、 POD、 CAT ）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS ， pH7.8) ：A母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 : 取Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14） 71.7g；B母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量 156.01） 31.2g。
分别用蒸馏水定容到 1000ml 。
0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液 (Na2HPO 4) 228.75ml ，B 母液 (NaH 2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至1000ml 。
加入 10gPVP （聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000： 267～ 268。
（2） 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：取 1.399g Met 用磷酸缓冲液（ pH7.8 ）定容至 100ml 。
网上说定容到 100ML 我也不懂。
拜托（ 3）100μ mol/L EDTA-Na 2溶液：取 0.03721g EDTA - Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g 核黄素用蒸馏水定容至100ml ，避光保存，随用随配，并稀释 10 倍（ 5）750μ mol/L 氮蓝四唑（ NBT ）溶液：称取 0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml 。
取 5ml 于 10000r/min 下离心10min ，上清液即为SOD 粗提液。
SOD氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx 日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法【实验目的】1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。
2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。
【实验原理】超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。
SOD 是含金属辅基的酶。
高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。
SOD 能够清除超氧阴离子自由基 （O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。
超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。
生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ：2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。
本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。
有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。
被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。
当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大光吸收。
当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。
于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。
抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。
常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。
【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱（光照度为4000lx ）、容量瓶（10ml ）、试管2. 实验试剂50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液； 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液；CATSOD100μmol/L EDTA- Na 2溶液； 20μmol/L 核黄素溶液；SOD 提取介质：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）内含1% PVP 。
超氧化物歧化酶(SOD)的检测方法SOD的催化使超氧自由基(O2-)被破坏，并针对氧毒性筑起了第一道防线。
SOD的活性及其检测技术与许多不同领域都息息相关，如医药、生化、植物生理、食品工程等。
在过去的几十年中，人们已经发现了各种各样的SOD检测方法，但是，这些方法在选择性、检测速度、价格、简便程度上都存在各自的缺陷。
最近，我们发现水溶性四唑盐如XTT，WST-1，WST-8适合用于O2-的检测并且也可以被用于SOD的检测。
在这些四唑盐中，WST-1灵敏度高，氧化态的吸光度低，水溶性好，因此，最适合用来做SOD检测。
这种用WST-1来检测SOD的方法可以被用于鼠红血球、心脏、肝脏等生化样品中。
我们还发现了一种使用了WST-1的流式注射法检测SOD的检测系统，通过这个系统能够进行快速的检测（每小时可以检测30个样品）。
常用的几种SOD检测方法：1.分光光度法分光光度法是最为典型的检测SOD的方法，这种方法使用了细胞色素C(cytochrome C)（图1）。
用cytochrome C的还原法来检测O2-是因为还原后的cytochrome 或者氮蓝四唑（NBT）C会生成紫色的染料（图解2）。
这是自SOD被发现以来最常用的方法Cyt(FeⅢ) + O2- —> Cyt(FeⅡ) + O2因为cytochrome C很容易被NADPH还原酶或者其他的还原剂所还原，因此必须要考虑样品的污染因素。
而且，这种方法需要每隔1.5分钟就要察看一下，因此不适合做大批量的实验。
NBT法的原理是生成不溶于水的蓝色甲臢染料(max: 560 nm)去和O2-反应。
这种染料不溶于水，在做长时程分析时会生成不均一的沉淀物，从而影响实验数据的重现性。
为了得到水溶性的甲臢染料，许多改良后的方法如添加BSA被人们所采用。
但是，添加了不必要的蛋白质会使数据分析变得十分复杂，而且NBT会被多种还原剂所还原。
NBT的这种特性被用于酮胺的检测，酮胺可以作为糖尿病的标记物并且是Maillard反应的中间体。
