基因工程原理复习题思考题
5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。）
6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？
类型：DNA连接酶和RNA连接酶
异同点：
相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案）
1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感
5、尽可能缩小连接反应的体积
6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好
8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？
1）大肠杆菌DNA聚合酶
2）Klenow fragment
3）T7 DNA聚合酶
4）T4 DNA聚合酶
5）修饰过的T7 DNA聚合酶
6）逆转录酶
7）Taq DNA聚合酶
第四章基因克隆的载体系统
1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；
具有合适的筛选标记；
具有较高的外源DNA的载装能力；
具有多克隆位点（MCS）；
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？
基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？
A、化学法（CaCl2法)转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。
B、电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。
影响转化率的主要影响因素:
1）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；
2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；
3）受体细胞的类型及预处理；
4）转化方法：电击法高于化学法。
5、重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。
从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以分为如下几个类型：
（1）基于载体遗传标记检测法
在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。
（2）基于克隆DNA序列检测法
Southern印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA 片段。
（3）基于外源基因产物检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。
第五章基因的克隆一般方法
1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理（至少3种，都是书上找的，自选哈，建议必选DD RT-PCR和SSH，原因请看下题）？
1）差减杂交（SH）
通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。
2）抑制性差减杂交（SSH）
SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。
3）差异显示PCR（DD RT-PCR）
利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。
4）DNA代表性差异分析（DNA RDA）
代表性差别分析是通过突变型（驱赶DNA，driver DNA）与野生型（检测DNA，tester DNA）基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。
5）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）
基因组DNA经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接
头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。
[
2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？
主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。
所需的mRNA量少。
各样本mRNA的差异可同时进行比较。
扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。
缺点：
假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。
工作量大。
无法定量研究。
扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。
利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发挥了极大的作用。（P221）
3、抑制性差减杂交的原理与应用。
原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。
应用：
基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；
基因时空表达的研究：如根、茎、叶；
不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。
4、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。
A．酵母双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是DNA特异结合域（DNA-binging domain,BD），一个是转录激活域(transcriptional activation domain,AD)。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。B．噬菌体表面展示技术原理：当外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时，如果两者读码框结构保持一致，这个外源DNA片段所编码的产物可与此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。
5、T-DNA标签法克隆基因的一般技术路线。
农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。
建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.
用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。
用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。
把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。
第七章克隆基因的表达
1、通过比较，分析大肠杆菌表达系统和酵母表达系统各有何优缺点。
大肠杆菌表达外源基因的优势：
4405个开放型阅读框架；
FDA批准为安全的基因工程受体生物。
大肠杆菌表达外源基因的劣势：
异源蛋白；
甲醇酵母表达系统的优点：
具有强的受严格调控的AOX1启动子
表达蛋白的翻译后的加工和修饰
营养要求低，工业化生产成本低
可高密度发酵
表达蛋白可存在于胞内和胞外
酵母表达系统的缺点：酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题（这个找不到，百度的）
2、如何提高克隆基因的表达水平？
1）、表达载体的优化设计；
2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性；
3）、密码子偏爱性；
4）、表达环境条件的优化。
3、克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些类型？
表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白
5、表达载体和基因工程一般克隆载体在元件构成上有何差别？
表达载体：启动子；终止子；核糖体结合位点（SD序列）；筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点
克隆载体：筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点
第八章植物基因工程
2、外源基因导入植物的方法主要有哪些？
物理方法：电击法、基因枪法(biolistic)、显微注射法、微激光束法
化学方法：PEG介导法、脂质体介导法
生物学方法：农杆菌介导法、花粉管通道法
四．问答题
（一）简答
4．某学生在用EcoR I 切割外源DNA 片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因。
答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。
5．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp 的II 类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么？
答：回文序列是5’-CATATG-3’。
6．下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II 类酶的识别序列：GAATCG、AAATTT、GATATC、
ACGGCA？为什么？
答：GATATC 和AAATTT，因为它们是回文序列。
7．用Klenow 酶填补的办法可使5' 黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA 上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失？BamH I (G↓GATCC)、Taq I (T↓CGA)、BssH II (G↓CGCGC)。
答：BssH II 不会。
四、问答题
2．DNA 连接酶的作用特点有哪些？
①连接反应需要在一条DNA 链的3’末端具有一个游离的-OH, 而另一条DNA 链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)的情况下，才能发挥其连接DNA 分子的功能作用，而在末端带有5’-羟基和3’-羟基；5’-磷酸和3’-二脱氧核苷基团的两个DNA 片段之间不起连接作用。
②连接反应中需要 ATP 或NAD+ 和Mg2+ 为辅助因子和激活因子；
③ DNA 连接酶不能够连接两条单链的DNA 分子，被连接的DNA 链必须是双螺旋的一部分。
④ DNA 连接酶只封闭双螺旋DNA 骨架上的缺口 (Nick)，即在双链DNA 的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭双链DNA 的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口（Gap）。
3．影响DNA 连接酶连接反应的因素主要有哪些？
答：1) 反应温度：最佳反应温度37℃，但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定，连接黏性末
端的最佳温度，一般认为4～20℃比较合适。
2) DNA 片段末端：不仅要考虑反应体系中DNA 末端的总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA 分子的末端有较高的几率与另一 DNA 分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段 3：1 ~ 1：3。
3) 连接酶浓度：平末端DNA 分子的连接反应，最适酶量大约是1～2 单位；而黏末端DNA 片段间的连接，在同样的条件下，仅为 0.1 单位时，便能得到最佳连接效率。
四、问答题
1．YAC 载体具有什么样的？为什么在克隆大片段时，YAC 具有优越性？
答：（1）功能性DNA 序列:
①来自于酵母的125bp DNA 片段的着丝点序列 (CEN4)。
②来自酵母的自主复制序列 (ARS1)，起始在酵母中的DNA 复制。
③来自酵母的端粒序列，它是 (5-TGTGGGTGTGGTG-3) 的多拷贝重复，它对染色体的复制和
维持是必需的。
④在酵母中进行选择的标记基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨酸合成基因）。寄主是这些基因的营养缺陷性，只有带有这些基因的转化体才能在选择培养基上生活
⑤具有细菌的复制起始点和选择标记基因。YAC 载体通常含有ColE1 的ori 和氨苄青霉素抗性标记基因，可以在大肠杆菌中复制和繁殖，所以它也是一种穿梭载体。
（2）优越性：YAC 能够容纳长达上千kb 的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
3．举例说明什么是穿梭载体？
答：穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA 片段的杂种质粒，有两个复制起点和能在两种不同细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主 (来回穿梭)。
5. 什么是YAC？YAC 克隆载体常出现哪些问题？
答：YAC 即酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome）的缩写，是人工构建的染色体样大容量克隆载体，基本组成有着丝点、能在细菌和酵母中进行复制的复制起始点和选择标记及端粒。最大DNA 克隆片段可达到2000kb。
问题有：(1) YAC 有嵌合现象，一个YAC 中克隆的DNA 片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的10％～60％。
(2) YAC 内部有重组现象，插入的DNA 较大，序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一致，重组很难检出。
(3) YAC 还有缺失现象，影响YAC 文库的代表性。
(4) YAC 结构和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC 和酵母天然染色体分开。
(5) 构建好的YAC 转化原生质化的酵母菌，转化效率低。
(6) 建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大
6．什么是 BAC？BAC 载体的组成与优缺点有哪些？
①细菌人工染色体（BAC）是从大肠杆菌F 因子改造构建而来的，能够携带大约300kb 的DNA 插入片段。
②载体具有 F 因子的复制起始点（oriS），可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。
③载体包括有 4 个维持DNA 复制和拷贝数目的基因，repE, parA, parB and parC。
④具有一个抗生素选择标记基因，和 lacZ’基因。在lacZ’基因中组装有一多克隆位点，便于外源片段的插入和蓝白反应筛选克隆子。
⑤插入的 DNA 片段非常稳定，可以在大肠杆菌细胞中维持数百代，而且不易发生重组和从寄主细胞中丢失。
⑥主要缺点是每个细胞中的拷贝数少（1~2 个），使得分离和筛选较为困难。
7．利用pBR322 质粒插入失活分离带有外源DNA 片段的重组克隆的原理是什么？
①外源 DNA 片段插入在pBR322 质粒tetr 基因的编码序列内（BamHI）位点，使该基因失活；
②体外重组反应混合物转化大肠杆菌 ampstets 菌株，并涂布在amp 琼脂平板上，凡获得了pBR322质粒和重组质粒(AmprTets)的寄主细胞都可长成菌落；
③将 amp 琼脂上的菌落原位影印在tet 琼脂平板上生长，对比这两个平板的菌落生长情
况，凡在amp平板上能够生长而在tet 平板上不能生长的菌落，便是属于带有重组体质粒的转化子克隆；挑出这样的阳性克隆，扩增分离带有外源DNA 插入片段的重组体质粒。
8. pUC 质粒利用α-互补作用筛选重组子原理是什么？
答：pUC 系列质粒载体是在pBR322 质粒载体基础上改造来的，它用lacZ’基因取代了pBR322质粒载体上的tetr 基因。lacZ’基因编码β-半乳糖苷酶的N 末端1-63 个氨基酸(α-肽链)的DNA 片段, 在lacZ’基因内组入了一个多克隆位点（MCS），但不影响lacZ’基因的功能。 pUC 载体的宿主（E. coli）携带一个编码β-半乳糖苷酶C 端序列的基因片段, 它们本身用这个基因片段产生的β-半乳糖苷酶片段是无活性的, 但它们可以通过α-互补作用在体内相互弥补, 即两部分产物可以结合形成有活性的β-半乳糖苷酶。当pUC 质粒引入大肠杆菌中，在含有指示剂X-gal 和 IPTG 的诱导培养基上培养时，菌落成蓝色。如果在MCS 插入外源DNA 片段（基因），破坏了lacZ’基因的功能（插入失活），不再产生α-肽链，不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶，形成的菌落是无(白)色的。因此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA 插入序列的重组体克隆。
9．自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColE1 和pSCl01 这两个自然质粒也不尽如人意，通常需要进行改造。请问质粒改造包括哪些基本内容?
答：
基本内容包括：
(1) 删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段；削减载体的分子质量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力。
(2) 加上易于选择或检测的标记。
(3) 限制性内切核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置。
(4) 加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达。
(5) 安全性改造，限定载体的宿主范围。
10．质粒制备的基本原理？
答：带有质粒的细菌细胞在SDS 作用下裂解，并在碱性条件下使DNA 变性。调节pH 值至中性时质粒DNA 首先复性，而细菌基因组DNA 不能复性而与SDS-蛋白质形成复合体，可以被离心沉淀除去。上清液中的质粒DNA 分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀纯化出来。
四、问答题
1．λ噬菌体DNA 被包装到噬菌体的头部需要哪些基本条件？为什么？
答：①两个cos 位点；②线性DNA；③分子大小在λ噬菌体基因组的75%～105%。
2．为什么野生型的λ噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体?
答：(1) 噬菌体DNA 没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA 包装的量是有限制的，不能大于基因组的105％，所以要将λ噬菌体改造成载体，必须削减本身的分子大小；
(2) 野生型的λDNA 对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆；
(3) 没有可供选择的标记；
(4) 野生型的λ噬菌体具有感染性，因此不够安全。
4．λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?
答：优点：(1) λ基因组中有1／3 的非必需区可以被置换。改造成载体后，克隆的片段较大(可达20kb)，而质粒载体的克隆片段只有几个kb；
(2) 用噬菌体λDNA 作为载体，即使不进行体外包装，转染的频率也比质粒转化的效率高，
包装后的效率就更高了；
(3) λ可通过溶原化反应整合到寄主染色体上，当不需要外源基因大量表达时，可让它以溶原性存在，若要表达，可通过诱导即可进入裂解途径，释放出大量的噬菌体，得到的重组DNA 的拷贝数就会很多。
缺点：(1) 包装比较麻烦，包装率不稳定，购买包装蛋白的费用高；
(2) 没有质粒的用途广泛。
5．以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体? 答：改造的置换型噬菌体载体，重组入外源片段之后，总体积不能超过入基因组的105％，不能小于又基因组的75％。以置换型λ噬菌体DNA 作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA 重组。如果没有外源片段，仅是两臂连接，长度短于久基因组的75％，不能被包λ噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，总长度超过λ基因组105％后，也不能包入噬菌体颗粒，自然也不能形成噬菌斑。
6．M13 系列载体具有哪些优缺点?
答：M13 克隆系统具有很多优点：
(1) 克隆的片段大：M13 噬菌体的DNA 在包装时不受体积的限制，所以容载能力大。有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA 长6～7 倍的 DNA(插入片段可达40kb)。
(2)可直接产生单链DNA，这对于DNA 测序、DNA 诱变、制备特异的单链DNA 探针都是十分有用的。
(3) 单链DNA 和双链DNA 都可以转染宿主，并可根据人工加上的选择标记进行筛选。
M13 克隆系列的不足：
(1) 较大的外源片段插入后，在扩增过程中往往不够稳定。一般说，克隆的片段越大，发生丢失的概率越大。
(2) 单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦。
7．黏粒载体具有哪些特点与不足?
答：主要特点有：
①柯斯质粒是含有λ噬菌体 COS 位点的质粒载体。柯斯质粒具有质粒的复制子，进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制，并且能够被氯霉素扩增。
②具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记和克隆位点。
③插入片段的消化、连接及后来重组克隆的纯化与质粒载体相同。
④具有λ噬菌体的包装和转导特性。与质粒载体转化细菌细胞不同，重组体像λ载体一样，需体外包装后转染细菌。
⑤包装后形成的λ颗粒用来感染大肠杆菌，重组DNA 像λ DNA 一样注入细菌细胞，并以COS位点环化。由于缺乏λ的其他DNA 序列，环化DNA 在细菌体内以质粒一样维持。⑥简化了筛选。载体体积小，承载外源 DNA 片段大。如果载体的分子质量在5kb 的话，得到的转导子几乎排除由载体自连的可能性，因为要被成功包装，至少要7 个分子的载体自连。尽管如此，也是不能被包装的，因为COS 位点太多了。重组体只有达到32-45kb 才能有效包装体外包装，这就提供了对重组体的正向选择。
⑦对转化体的选择是基于载体上的抗生素标记。
⑧感染后形成菌落，而不是噬菌斑。
黏粒载体也有如下不足：
①如果两个黏粒之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使被克隆的片段重排或丢失。
②含不同重组 DNA 片段的菌落生长速度不同，会造成同一个平板上菌落大小不一。另外由
于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同，会造成文库扩增量的比例失调。
③包装过程复杂，包装效率不稳定，代价高。
四、问答题
1．怎样将一个平末端的DNA 片段插入到EcoR I 的限制位点中去？
答：可以化学合成一个连接子（linker），即一段长为lObp 含有EcoR I 识别位点的短的DNA 片段，
然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoR I 切割这种连接片段，就会产生EcoR I 的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoR I 的限制性核酸内切酶位点中。
2．构建基因组文库时为什么要对基因组DNA 进行部分酶切？（列举至少两条理由）
答：①部分酶切可获得长度适宜的片段（如获得中等长度的酶切片段）；②部分酶切可保证切出的DNA 片段内部依然保留了部分限制酶位点，便于后续的克隆分析。
3．什么是基因组文库(genomic library)？它同遗传学上的基因库有什么不同?
答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA 的各种片段的克隆群。
包括下列过程：高分子质量染色体DNA 的制备；体外重组连接；将重组DNA 导入寄主细胞并扩增；筛选。
基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene poo1)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC 文库、BAC 文库等。
4．什么是cDNA 文库？同基因组文库有何差别?
答：同mRNA 互补的DNA 称为cDNA。cDNA 文库是以某一生物的总mRNA 为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA，即第一链，破坏RNA 模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA 称为cDNA。选用适合的载体，将合成的cDNA 重组导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA 克隆群称为cDNA 文库。由于cDNA 技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。
由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA 文库是不可能构建得十分完全的，也就是说，任何一个cDNA 文库都不可能包含某一生物的全部编码基因。
cDNA 文库与基因组文库的主要差别是：
(1) 基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA 序列；cDNA 文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。
(2) 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA 文库克隆的是不完全的编码DNA 序列，因它受发育和调控因子的影响。
(3) 基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；而cDNA 克隆的是不含内含子的基因。
6．如何使用甲基化酶对克隆DNA 进行保护？有什么意义？
答：在构建基因文库时，可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆DNA 先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。
意义：用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。
8．某一质粒载体具有Tetr 和Kanr 的表型，在Kan 抗性基因内有一Bgl I 的酶切位点。现用Bgl I 切割该载体进行基因克隆，问：①转化后涂皿时应加什么样的抗生素? ②培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型? ③如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?
提示：①加四环素；
② Tetr Kans 和Tetr Kanr；
③重新点种在含Tet、Kan 和只加Tet 的平板上，选择只在Tet 平板上生长的菌落，即为所
需的重组体。
9．限制性内切核酸酶BamH I 和Pst I 切割某一DNA 序列，结果如下所示。
5’------G↓GATCC-------3’ BamH I ------G GATCC------
3’------CCTAG↑G------5’ ------CCTAG G------
5’------CTGCA↓G------3’ Pst I ------CTGCA G------
3’------G↑ACGTC------5’ ------G ACGTC------
(1) 指出被切割DNA 分子的5’端和3’端；
(2) 如果你将切割后的DNA 同DNA 聚合酶、4 种dNTP 在一起温育，这些DNA 末端会有什么样的变化?
(3) 经过(2)中的反应后，你还能够用T4 DNA 连接酶将BamH I 末端连接起来吗？Pst I 末端呢？(T4 DNA 连接酶能够连接平末端和黏性末端。)
(4) 在(3)中的连接后，能够重新形成BamH I 位点吗？Pst I 位点呢？为什么？
答：(1) 切割后分子的5’和3’端 (如图示)：
(2) 如图所示，BamH I 的末端能够被DNA 聚合酶填补，而Pst I 的末端却不能。这种差异是由DNA聚合酶的作用条件所决定的：dNTP 只加到具有3'-OH 的引物上，并且要有一条保证正确添加的模板链。BamH I 的末端可以满足这些条件，但Pst I 的末端却不能，因其具有隐蔽的5’端，这种末端是不能作为引物的，故不能被填补。
(3) 如图所示，平末端化的BamH I 末端和未被修饰的Pst I 末端二者都能被T4 DNA 连接酶连接。
(4) 连接处理过的末端可以再产生Pst I 的位点，但不会产生BamH I 的位点（画图说明）。切割、填补末端并重新连接，常会产生新的限制酶酶切位点，这些位点对于进一步的操作有时是有用的。
10．从基因组DNA 文库中分离的一段DNA（如下图所示），其中有一编码基因（黑框），图中给出了几种限制性内切核酸酶的作用位点。该图同时给出了用作表达该基因的表达载体，弯曲箭头是启动子的转录方向，并给出了几种酶的作用部位。
请根据此图，回答下列问题：
(1) 给出限制性内切核酸酶Pst I、BamH I、EcoR I、HindH I 和Cla I 所在部位的遗传学名称。
(2) 如果你打算用该表达载体表达DNA 片段中的基因，该片段应如何插入表达载体？
(3) 如果只想表达该基因的一部分，以获得部分表达的蛋白质用于制备抗体，应如何操作?
(4) 如果你需要将整个基因在表达载体中表达，应如何操作？是用单酶切还是双酶切？答：(1) 多接头区域（MCS）,也叫多克隆位点。
(2) 主要是插入的方向问题。因为启动子的转录方向必须与基因的方向一致，所以该DNA 必
须倒转180°插入，即5’端必须紧挨启动子。
(3) 用EcoR I 切割载体和基因组DNA，用连接酶重组后筛选重组体，通过测序确定正确方向的重组体进行蛋白质表达。
(4) 可用Pst I 和Hind III 双酶切割基因组DNA 和表达载体DNA，这种切割可将基因组DNA 片段定向克隆入表达载体。’
四、问答题
1．构建表达载体应注意些什么？
答：(1) 构建表达载体的关键是用于表达克隆序列的启动子类型，如果目的是基因的高效表达，就要选用强的启动子；如果表达产物对寄主细胞有毒性，可选择弱的启动子，最好使用可诱导型启动子，使在一定的条件下表达。
(2)表达载体还应具有以下组成元件：
①携带能在寄主细胞中维持的复制的起始点。
②具有抗生素选择标记或其他选择机制。
③在紧接启动子的下游安排限制性位点，用于插入需表达的基因。
④具有单一的酶切位点来克隆基因，克隆位点应位于准确的位置，以使克隆基因有效表达。
3．插入失活法和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么？
答：主要差别是：
(1) 插入失活法是直接根据失活基因的表型变化来筛选重组体。
(2) 插入表达法是根据一个基因的失活引起另一个基因的表达表型来选择。
4．一个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoR I 消化。消化物与酵母DNA 连接后转化对两种抗生素都敏感的E. coli 菌株。
(1) 利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞？
(2) 怎样区分接受了插入酵母DNA 的质粒的克隆？
提示：(1) 选择Ampr 的转化子；
(2) 所需的克隆是Ampr 和Kans。任何能够抗这两种药物的克隆都是自连的非重组质粒。
5．用EcoR I 和Hind III 分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆。在前者的克隆中筛选到A 基因，但在后者的克隆中未筛选到A 基因，请说明原因。
提示：因为HindH I 的切点位于A 基因内。
7．用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tetr 的质粒载体，已知该酶识别的是4 个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac 基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA 聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tet- 受体菌，筛选Tetr 转化子，问：Lac 的基因型是什么？并说明原因。
提示：基因型是lac—，原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac 的基因是缺陷的。
10．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA 而不用基因组DNA? 为什么要在cDNA 前加上细菌的启动子？
答：这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子的原因。
11．如何根据下面的应用设计探针？
(1) 假定你分离纯化了一未知功能的蛋白质，需要确定是何种组织和细胞表达这种蛋白质。
(2) 假定你获得了绵羊的胰岛素mRNA，如何进一步从人的cDNA 文库中获得含人胰岛素的克隆并使之在E. coli 中表达?
提示：(1) 首先对该蛋白质进行部分测序，然后根据测得的氨基酸序列设计简并引物。(2) 以该mRNA 为模板反转录，得到cDNA，即可进行标记用作探针。
13．单链RNA 作为探针，具有哪些单链DNA 探针所没有的优点？
答：单链RNA 探针的下列优点是单链DNA 探针所没有的：
(1) RNA／RNA 和RNA／DNA 比DNA／DNA 杂交体具有更高的稳定性。因此，杂交可以在更严格的各件下讲行．杂交后的信号也比较强。
(2) 单链RNA 由于不存在互补双链的竞争性结合，所以杂交效率比较高。
(3) RNA 中不存在重复序列，所以特异性比较高。
(4) 杂交后可用RNase 消化掉未杂交的RNA，因此降低了本底。
四、简答题（每题 6 分,共 24 分）
1. 酵母作为真核基因的高效表达系统有什么优缺点？克服大肠杆菌表达系统的不足，能繁殖快，高密度发酵，可以进行蛋白质翻译后的修饰合加工。缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等例如甲醇酵母系统，利用甲醇作为唯一碳源。乙醇氧化酶将甲醇氧化为甲醛，乙醇氧化酶的启动子是强启动子，编码乙醇氧化酶的基因是 AOX1 合 AOX
2.AOX1 基因的表达受甲醇严格调控，诱导表达水平可达 30％以上。
五、问答题（每题 8 分，共 16 分）。
2. 基因组文库构建的基本步骤是什么？构建基因组文库需要用到哪些载体？
步骤①载体的制备；
②高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取；③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）；
④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。
载体的选择：λ噬菌体，YAC,BAC,粘粒等。
基因文库构建的一般步骤：
（1）染色体DNA大片段的制备
①酶切法
②物理切割法
（2）载体与基因组DNA大片段的连接
①粘性末端直接连接
②人工接头法
（3）转导受体
（4）筛选重组子
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。
cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。
cDNA文库的特点
优点：分离的目的基因可直接用于表达；比DNA文库小的多，容易构建
缺点：只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子以及与核糖体识别的序列
构建cDNA文库的一般步骤：
（1）总RNA（total RNA）提取
（2）mRNA的分离纯化
①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。
② mRNA的分离纯化 Column（柱）
（3）cDNA的合成
① cDNA第一链合成
②降解mRNA模板
③ cDNA第二链合成（cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。）
（4）cDNA与载体连接：
（5）噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖）
基因的化学合成：寡核苷酸单链的化学合成；探针的化学合成；连接子和接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合成
目的基因的分离：
目的序列已知：一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因
目的序列未知：差异表达序列；无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法
第七章高等动物基因工程
1、基因导入细胞内的方法
物理方法：裸DNA直接注射、电穿孔、显微注射
化学方法：磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子-质粒复合物法
生物学方法——动物病毒载体：腺病毒、 SV40、腺相关病毒、反转录病毒、人牛痘病毒、疱疹病毒等。
反转录病毒（单链RNA病毒）
优点：
A、宿主范围广（几乎所有类型哺乳动物细胞）
B、效率高，可以感染大量的细胞，通常一次可以感染106～107细胞
C、外源DNA在整合时不发生重排，单位点、低拷贝整合（一般不超过5个）
缺点：
A、只感染分裂细胞
B、携带外源基因的长度有限(8kb)
C、载体病毒基因有潜在的致病性，如存在载体与人内源性逆转录病毒（HERV）序列间发生
D、重组而产生有感染能力的人逆转录病毒的潜在危险
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
第二章Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP（NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端； 2. 平末端； 3. 平末端加尾； 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶 功能：5’至3’单链聚合 作用特点：单链；无模版 作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dA TP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接 ---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 精品文档
2013-2014 年度第二学期基因工程期末考试 卷型： A 考试时间： 90 分钟满分：100分 一、名词解释（ 3×5） 限制性内切酶 ( 或其它工具酶 ) ：能在特异位点上催化双联 DNA分子断裂，产生相应的限制性 DNA片段 荧光定量 PCR: 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法（半定量 PCR: 是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过 mRNA反转录成cDNA，再进行 PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量）星活性：非标准条件下切割相似序列，产生非特异性片段 同裂酶（或同尾酶）：来源不同但具有相同识别序列，产生相同或不同末端 转基因技术（或转基因动植物等）：就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的 生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。二、填空（ 1×15） 1.Cosmid 实际上是由 cos 位点和质粒构成的杂合载体，也可以说是带有 cos 序列的质粒。 2.超螺旋质粒 DNA、开环质粒 DNA、线状质粒 DNA 在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒>线状质粒 >开环质粒。 3.质粒 DNA的提取方法有碱裂解法、煮沸法、去污法。 4.基因工程中常用载体是质粒、噬菌体、动植物病毒。 5.设计引物是一般要求 C+G的比例在 40%-60%，长度在 17-30bp 。 6.BAC 载体与常规载体的区别在于复制单元的特殊性。 三、选择题（ 2× 15，实卷应是1×35） 1.基因工程创始人（ D） A A. Kornberg B W. Gilbert C P. Berg D S. Cohen 2. 迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（ A.既可以作用于双链DNA ，又可以作用于单链 B. 只能作用于单链DNA C）DNA C.只能作用于双链 DNA D.只能作用于 RNA 3.氨苄青霉素的工作原理为（ A ） A. 可以抑制细胞壁肽聚糖的合成 B. 可以抑制核糖体的转位 C. 可以与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成 D. 可以与核糖体 30S 亚基结合并抑制蛋白质合成 4.反转录酶是一种（ C） A. 依赖C. 依赖DNA的RNA 的DNA聚合酶 DNA聚合酶 B. D. 依赖 依赖 DNA的 RNA聚合酶 RNA的 RNA聚合酶 5.II类限制性内切核酸酶( A ) A．仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供B．限制性识别非甲基化的核苷酸序列 C．有外切核酸酶和甲基化酶活性
基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶 第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过________________________，赋予生物以 _____________________，创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的，又叫做__________________。 1. （1 （2 （3 2. (1)两种DNA ②区别：E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. （1 （2 _____________________的双链___________DNA （3）其它载体： _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序 第一步：__________________________ 1.目的基因是指： ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得，也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方 法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：_____________________ 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________________，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞：★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少， 最常用的原核细胞是 ____________，其转化方法是：先用 ________处理细
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。 质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。 从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和Triton X-100：使细胞膜裂解。 染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。 基因组DNA的提取 植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。 细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）-- 沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）-- 抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNase A，CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。 总RNA制备 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。 RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS, 尿素等。 细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末） 异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。 酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。 Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。 mRNA提取 制备mRNA原理：分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。 琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳：琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺-- 小片段，分辨力高。
第一章 一、电泳 电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。 影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。 4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。 指示剂：溴酚蓝（Bb）：常用指示剂。分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。二甲苯青(Xc)：分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。 染料：溴化乙锭（EB） 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。 2 、SDS-PAGE 原理：SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。
蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。 二、PCR技术 定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。 PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。 影响因素：（1）Taq DNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。 （2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。 （3）引物的Tm值：实际复性温度选择低于Tm值5 oC。 （4）dNTPs 含量适中 （5）Mg 2+ 的浓度 （6)对照实验 三、PCR技术的扩展：反向PCR：不对称PCR：差异显示PCR。反向PCR 原理：扩增两个引物外侧的未知序列，使引物的外侧序列“转变” 成内侧序列。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，
2013-2014年度第二学期基因工程期末考试 卷型：A 考试时间：90分钟满分：100分 一、名词解释（3×5） 限制性内切酶(或其它工具酶)：能在特异位点上催化双联DNA分子断裂，产生相应的限制性DNA片段 荧光定量PCR:所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 （半定量PCR:是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量） 星活性：非标准条件下切割相似序列，产生非特异性片段 同裂酶（或同尾酶）：来源不同但具有相同识别序列，产生相同或不同末端 转基因技术（或转基因动植物等）：就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。 二、填空（1×15） 1.Cosmid 实际上是由cos 位点和质粒构成的杂合载体，也可以说是带有cos 序列的质粒。 2.超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA 在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒>线状质粒>开环质粒。 3.质粒DNA的提取方法有碱裂解法、煮沸法、去污法。 4.基因工程中常用载体是质粒、噬菌体、动植物病毒。
5.设计引物是一般要求C+G的比例在40%-60%，长度在17-30bp 。 6.BAC载体与常规载体的区别在于复制单元的特殊性。 三、选择题（2×15，实卷应是1×35） 1.基因工程创始人（D） A A. Kornberg B W. Gilbert C P. Berg D S. Cohen 2.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C） A. 既可以作用于双链DNA ，又可以作用于单链DNA B.只能作用于单链DNA C. 只能作用于双链DNA D.只能作用于RNA 3.氨苄青霉素的工作原理为（A ） A.可以抑制细胞壁肽聚糖的合成 B.可以抑制核糖体的转位 C.可以与核糖体50S 亚基结合并抑制蛋白质合成 D.可以与核糖体30S 亚基结合并抑制蛋白质合成 4.反转录酶是一种（C ） A. 依赖DNA的DNA聚合酶 B. 依赖DNA的RNA聚合酶 C. 依赖RNA的DNA聚合酶 D. 依赖RNA的RNA聚合酶 5.II 类限制性内切核酸酶( A ) A．仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 B．限制性识别非甲基化的核苷酸序列 C．有外切核酸酶和甲基化酶活性
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
一、单选 1、第一个实现DNA重组的实验:1972年，美国斯坦福大学医学中心的P.Berg在世界上第一次成功地实现了DNA的体外重组。 2、第一次实现重组体转化成功的实验：1973年，科恩（Coher）和博耶（Boyer）建立的基因工程基本模式。 3、基因工程研究的主要内容：切接转增检。 4、基因工程研究的基本要素：基因、工具酶、载体、受体细胞。 5、DNA在生物体内的存在状态：染色体DNA、病毒DNA（噬菌体DNA）、质粒DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，有的以线型存在，有的以环状存在。 6、天然DNA提取的步骤：生物材料的准备、裂解细胞、分离抽提DNA。 7、DNA的分离抽提法：酚-氯仿抽提法（常用、经典）。 8、DNA的保存：温度越低越好，同等条件下，温度越低越不容易降解。 9、为了消除在制备RNA过程中RNA酶的污染，应用0.1% DEPC处理过的水配制试剂。 10、人工合成DNA片段的方法有化学合成法和聚合酶链式反应扩增法。 11、紫外分光光度法检测核酸样品的纯度（常用），纯净的核酸溶液的0D260/OD280值应为 1.7~2.0，0D260/OD230值应大于 2.0，如果0D260/OD280小于1.7，可能有蛋白质污染，如果0D260/OD280大于2.0
或0D260/OD230小于2.0时，核酸溶液中可能存在其他干扰物质。12、工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶。 13、 14、通常提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言，限制性核酸内切酶的命名：属名+种名。例如：B acillus am ylolique faciens H、 H aemophilus in fluenzae dⅠ→Bam H、Hind 15、限制性内切核酸酶的本质：细菌细胞的限制—修饰系统。 17、常用的酶切方法：单酶切、双酶切和部分酶切。
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
一、名词解释 1、分子生物学 2、基因工程 3、DNA的变性与复性 4、细胞学说 5、遗传密码的简并性 6、DNA半保留复制、半不连续复制 7、SD序列 8、开放阅读框（ORF） 9、多顺反子 10、蓝白斑筛选 11、中心法则 12、限制修饰系统 13、断裂基因 14、单链结合蛋白 15、核酶 16、密码子家族 17、TA克隆 18、PCR 19、SNP 20、操纵子学说 21、DNA重组技术 22、减色效应-增色效应 23、可变剪接 24、反转录 25、同尾酶 26、加帽反应 27、蓝白斑筛选 28、表观基因组学 29、DNA的溶解温度 30、DNA的大C值 31、重叠基因 32、引物酶 33、逆转录 34、限制性内切酶 35、载体的选择标记 36、DNA甲基化
37、端粒 38、端粒酶 39、前导链 40、启动子 41、反式作用因子 42、同义密码子 43、多克隆位点（MCS） 44、基因组计划 45、C值悖论 46、顺式作用元件 47、胸腺嘧啶二聚体 48、寄主的限制修饰现象 49、拓扑异构酶 50、DNA的溶解 51、拓扑异构体 52、间隔基因 53、假基因 54、同源异型蛋白 55、翻译 56、多重PCR 57、抗终止作用 58、SD序列 59、空载tRNA 60、cDNA RACE 61、分子杂交 62、cDNA文库 63、载体 64、RT-PCR 65、反义RNA 66、延伸tRNA 67、起始tRNA 68、探针 69、反式剪接 70、增强子 71、动物基因工程 72、基因组 73、限制性内切酶 74、单顺反子
75、密码子 76、转录 77、RNA干扰 78、中心法则 79、回环模型 80、TATA box 81、前导链 82、目的基因 83、RFLP 84、RACE 二、判断 1、大肠杆菌DNA生物合成中，DNA聚合酶I主要起聚合作用。( ) 2、DNA半保留复制时，后随链的总体延伸方向与先导链的延伸方向相反。( ) 3、原核生物DNA的合成是单点起始，真核生物为多点起始。（） 4、以一条亲代DNA(3’→ 5’)为模板时，子代链合成方向5’→ 3’，以另一条亲代DNA链 5’→ 3’为模板时，子代链合成方向3’→ 5’。（） 5、RNA的生物合成不需要引物。（） 6、大肠杆菌RNA聚合酶全酶由4个亚基（α2ββ’）组成。( ) 7、大肠杆菌在多种碳源同时存在的条件下，优先利用乳糖。 ( ) 8、在DNA生物合成中，半保留复制与半不连续复制指相同概念。（） 9、逆转录同转录类似，二者均不需要引物。（） 10、真核生物染色体核心组蛋白的乙酰化、组蛋白H1的磷酸化，都会使基因得以失活。（） 11、在原核细胞中，起始密码子AUG可以在mRNA上的任何位置，但一个mRNA上只有一个起 始位点。( ) 12、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别mRNA上的密码子。( ) 13、表观遗传效应是不可遗传的。( ) 14、cAMP与CAP结合、CAP介导正性调节发生在有葡萄糖及cAMP较高时。( ) 15、DNA甲基化永久关闭了某些基因的活性，这些基因在去甲基化后，仍不能表达。 （） 16、RNA聚合酶催化的反应无需引物，也无校对功能。( ) 17、基因是存在于所有生命体中的最小遗传单位 18、人类基因组中大部分DNA不编码蛋白质 19、蛋白质生物合成过程中，tRNA在阅读密码时起重要作用，他们的反密码子用来识别 mRNA上的密码子。 ( )
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA 分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基 生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA 连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30 多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有
高三生物知识点归纳：基因工程及其应用 1.概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 高考生物知识点归纳 2.原理基因重组 3.工具： A.基因的”剪刀”：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的”针线”：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的”运载工具”：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。 c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。 4.基因操作的基本步骤： ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基
因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）