酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究

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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法

4)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融
合子的可能性。
5)有可能采用产量性状较高的菌株作融合 亲株。 6)提高菌株产量的潜力较大。 7)有助于建立工业微生物转化体系。
四、细胞融合过程
显微镜下的原生质体融合
融合过程中细胞膜变化

类脂质分子发生扰动和重排 导致细胞桥的形成 细胞质、核相互融合
都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型 或抗药性等
2、原生质体融合的方法

物理法、化学法及生物法 。
原理 增加细胞间的粘附、改变膜的通透性—— 随机结合、融合
(1)物理法——电融合诱导法

在直流电脉冲的诱导下，极化产生偶极子， 彼此靠近，定向排列成串球状。
在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧 产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄， 触发膜的穿孔（质膜瞬间破裂）。 膜之间形成通道，细胞质等得以交换、融 合。


原理与过程



灭活后的病毒颗粒结合到原 生质体表面。两受体细胞开 始凝聚。 两细胞的膜紧密结合。病毒 被膜与受体细胞的浆膜融合 。病毒颗粒周围的膜脱离整 个膜，产生破口，在两细胞 间形成细胞质通道（37℃下 1-2min），通道继续扩大， 病毒颗粒流入细胞质内，细 胞质互相融合。 融合细胞变圆，融合结束。
特点

研究最早的促融剂。 毒性大而使应用受到限制。
(3)化学法

包括PEG诱导、高Ca2+和pH诱导PEG结合诱导等。 聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，分子式为 H(OHCH2-CH2)nOH)。 PEG诱导：PEG与溶液中自由水结合，高度脱水后 引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发 生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻

③易进行载体DNA的导入。DNA转化技 术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率；
④培养条件简单，容易进行高密度 发酵；
⑤能将外源基因表达产物分泌到培 养基中；
⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻 译后的修饰功能。
2.缺陷在于：
①表达效率相对低； ②酵母常有密码子偏爱性，真核基
因在其中表达时需要人工修正。
2.含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建
①ARS为酵母菌中的自主复制序列，大 小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp 就有一个ARS元件。
②由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而 由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp。
③上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数 最高可达200个，但是经过几代培养 后，质粒丢失率达50%-70%，主要由 于分配不均匀所致。
三．抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬 酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影 响蛋白质的生物活性。整个糖单位 由糖基核心和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿 酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修 饰和加工系统对来自高等动物和人的异 源蛋白活性表达是极为有利的，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很 难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基 化缺陷菌株非常重要。
②YAC载体的装载量建
①YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母 片段只提供选择性标志，没有复制起点。
②转化率低（只有1-10转化子/微克DNA）， 但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。
一．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：

二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制
A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
酿酒酵母（Saccharomyces cereviasiae）：
*无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作 *基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理
B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子
C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭
D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达
2、酿酒酵母分泌系统
酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如Li+等）、PEG和热休克处理诱

ｐ ｏ ｅ ｓ ｆ ｒ ｄ ｃ ｎ ｅｙ ｕ ｇｍ ｙ ｅｉ ｍ ， ｈ ｇ ｆｓ ａｎ ｒ ａ ｙ ｔ ｅｃ ｎ ｒ ｌ ｄ ａ ｄｔ ｅｅ ｐ ｒ ｅ ｔ ｒ ｃ ｄ ｒ ｓ ｒ ｃ ｓ ｏ ｕ ｉ ｇ ｔ ｏ ｎ ｃ ｌ ｏ ｐ ｈ ｕ ｔ ｅ ａ ｅ ｏ ｒ ｉ ｓａ ｅｅ ｓ ｂ ｏ ｔｏ ｌ ｎ ｘ ｅ ｍ ｎ ｓ ｏ ｅ ｕ ｅ ｔ ｏ ｅ ｈ ｉ ｐ
ｅ ｙ ｏ ｙ ｉ ｉ ｎｄ ｐ ｒｆｃ ｔｏ ｎ ｅ ｎｅ ａｉ ｎ ｐ ｏ ｅ ｓｆ ｒｔ ｅｐｒ ｔ ｐ ａ ｔ Ｔｈｅｅ ｐｅ ｍ ｅ ｔ ｈ ｗｅ ｈａ ： ｎｚ ｍ ｌ ｓｓｔｍｅ ａ ｕ ｉ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｒ ｇｅ ｒ ｔｏ ｒ ｃ ｓ ｈ ｏ ｏ ｌ ｓ． ｉ ｏ ｘ ｒ ｉ ｎ ｓｓ ｏ ｄ ｔ ｔ Ｉ ｈｅ ｎｔ
Ａｂｓ ｒ ｔ ｔ ａｃ Ｃｏ ｉ ｒｎｇ ｔ ｅ ｇ ｂ ｒ ｌｉ — ｏ ｕｃ ｎｇ ｓｒ ｉ ｒ ｎｓｄｅ ｉ ｈ ｉ ｂｅ ｅ ｌｎ ｐｒ ｄ ｉ ｔａｎｓ ａ ｅ ｍｕｌｉ ｕｃ ｅ ｔ ｔｎ ｌ ａ ｅ ｍｙｃ ｌｕ ｗｉｈｏ ｐ ｒ ｓ ｔｉ ｅ ｉ ｍ ｔ ｕｔｓ ｏ ｅ 。ｉ ｓ
ｎｅ ｅ ｓ ｒ ｏ ｍａ ｅ ｔ ｅ ＧＡ ｃ ｓ ａ ｙ ｔ ｋ ｈ ｍｙｃ ｌｕ ａ ｎ ｅ ｉ ｍ ｕｍｂ ｒｏ ｉ ｉ ｕ １ｆｅ ｏ ｏ ｌ ｓｓｂｙ ｍｅ ｎｓｏｆｅ ｙｍｏ ｙｓｓｆ ｒｔ ｅｌ ｅ ｆｉ ｖ ｄ ａ ｅｐｒ ｔ ｐ ａ ｔ ａ ｎｚ ｎｄ ｒ ｌ ｉ ｏ ｈｅ ｃ ｌ ｗａ ｌｂ ｆ ｒ ｒ ｔ ｐｌｓ ｈｙ ｉ ｃ ｅ ｃ ｌｉ ｄ ｅ ｕ ａｉ ｎ ｂ ｒ ｌ ｎ— ｒ ｄ ｃ ｎ ｔａ ｎ． ｌ ｅ ｏ ｅ ｐ ｏ ｏ ａ ｔｐ ｓｏ ｈ ｍｉａ ｎ ｕｃ ｄ ｍ ｔｔｏ ｏｆｇｉｂｅ ｅ ｌ ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｓｒ ｉ Ｅｍｐｌ ｙ ｎ ｈ ｃ ｏ ｒ ｓ ｉ ｏ ｉ ｇ ｔ ｅ ｍｉ ｒ ｐｏ ｏｕ ｍｅ ｒ ｎｅ ａ ａ ｒｅ ，ｔｎｄ ｒｍｙ ｅ ｉ ｍ ａ ｕｌｉ ａ ｅ ｎ ｈｅ ｓ ｉ ａ ｅ ｃ ｔ ｉ ｉ ｍｂ ａ ｓ ａ ｃ ｒ ｉｒ ｅ ｅ ｃ ｌｕ ｃ ｎ ｂｅ ｃ ｔｖ ｔ ｄ ｉ ｔ ｏｌｄ ｐｌｔ ｏｎ ａ ｎ ｎｇ ｍｙｃ ｌ ｅｉ ｕｍ ｒ ｗｔ ｅ ｕｍ ｇ ｏ ｈ ｍ ｄｉ

质体融合技术在育种研究 中应用较多。文铁桥等用酿酒
酵母和克鲁维酵母进行属间原生质体融合 ，获得的融合
酵母属 （ ｉ ｉ）等酵母 的选育 。研究表 明 ，这些酵母 Ｐｃ ａ ｈ 会对果酒的总体风味产生积极的影响 ，能生成很多芳香 物质和特殊风味成分 ，使酒的风味特征明显改善 ＿。人 ２
子在４ ℃下能进行酒精生产。Ｄ ｑ ｉ ｔ ８等将干酪乳 ５ ｅｕｎ ｏ １ ｅ ｕ［
生产工艺研 究，并对我 国果酒的发展 、存在 问题 以及前景作 了探讨 。 关键词 ：果 酒；发酵酵母 ；香味 ；陈酿
果酒是以水果为原料经过发酵而成的低度饮料酒 ，
（ ａ ｓｎ ｌ ｍ ａ ｉＩＯ ０ ９ ）具有 明显的产酯酶 的能 Ｈ ｎｅｕａ ｒｋｉＦ ８ ５ 力 ，其原理是孢汉逊酵母只利用乙酸乙酯作为唯一的碳
富含糖 、有机酸、酯类及多种维生素 ，特别是葡萄酒 、
剌梨酒 ，ＶＣ 含量 高 ，含有 丰富的具有增强免疫功能 的
Ｓ ＯＤ” 。我国地 域辽阔 ，果树种类繁多 ，然而 ，由于
源，为乙酸异戊酯的产生提供酯酶，从而发酵产生乙酸
异戊酯等芳香类物质 。然而，产酒精效率与果酒的风味 同等重要 ，纯种酿酒酵母不是万能的，Ａ ｏ ｕ＿等人研 ｙｇ ５ Ｊ 究发现 ，用 于生产棕榈酒 的发酵液 中分离的酿酒酵母 （ａ ｃａｏ ｙｅ ｒｖ ｉｅ Ｓ ｃｈ ｒｍ ｃｓ ｅｅｉａ ）的变异种不同于商业的酿 ｃ ｓ 酒 酵母 ，在 用于生产菠萝酒 中，前者 的发酵产酒率 达 １．％ （ ／ｖ ０ ２ ｖ ），显著高于后者 的７ ％ （ ／ｖ ． ４ ｖ ）。 １ ２ 应用现代育种手段进行菌种选育 ． 现代育种手段进行菌种选育可以使菌种的生产性状 有 明显的改善和提高，如诱变育种、杂交育种 、原生质 体融合 、基因工程技术 。诱变育种是以诱发突变为基础

等，从红葡萄酒中筛选出一株能高产氨基甲酸
乙酷的酵母菌。 １ 现代育种手 筛 ． ２ 段 选果酒酵母 诱变育 种、 杂交育种、原生质体融合、 基因克隆和转化 技术等一些现代育种技术可使菌种的生产性状 有 明显 的 改善 和 较 大幅 度 的提 高 。 比如 ， Ｒ ｍａ ｏ ｏ ｎ 完成一株絮凝性强的酵母与～株不产 Ｓ Ｏ 的酵母杂交，获得了既不产同时凝聚性也较 强的酵母用于葡萄酒的生产。Ｒ ｉｉ 完成筛自 ａ ｅ ｎｎ 乳清的酿酒酵母与葡萄汁酵母的杂交， 获得了 同时具有两个亲本优良 特性的杂合子， 该株菌 分解苹果酸的能力强和生成乙酸能力弱。文铁 桥等用酿酒酵母和克鲁维酵母进行属间原生质
７ｌ 成的 低 一类 度酒精 料。 酒营 饮 果 养丰富， 玉荣等利用原生质体融合技术得到用于葡萄酒
ｌ 、果酒酵母选育新技术 传统发酵法利用的是环境中的微生物，而 使用筛选的纯种酵母进行发酵不仅可以提高生 产效率，并且使酒的酿造便于控制，保证安全高 效生产。世界上一些果酒生产大国 （ 美国、澳大 利亚、南非等）都进行了这发面的研究。 １ 自 ． 然酵母的筛 １ 选方法 纯种酿酒酵母 酿制的果酒风味平淡， 果香味不充分，因 此选育 水果上存在的一些产香酵母、产酯酵母， 如孢汉 逊酵母属 （ ｎ ｅ ｉｓ ｏ ａ 、克勒克酵母属 Ｈａ ｓｎ ａｐ ｒ ） （ｌ ｄｅａ、假丝酵母属 （ａｄ ａ、 Ｋｏ ｋｒ） ｅ Ｃｎ ｉ ） 毕赤酵 ｄ 母属 （ｉ ｉ）等，可以很好的池长期存放去掉生酒味的方法。 龙建新发明了一种酒类快速崔陈新材料 ， 将多种功能材料配合成型后，经煅烧及熔化而 成的两种制造工艺制成，泡入酒中可以使酒类 加速催陈， 使酒昧达到香醇可口，并对人体有 益，减轻了酒味中的苦、辣、 涩、 酸、 麻的异味。 赵波发明了磁化矿化老熟酒类、饮料催陈 技术，它由 磁化催陈机与电解矿化催陈机组成， 其原理采用磁化、矿化和通过电解制取臭氧热 物理过程，达到催陈老熟酒类、饮料目的，其内 胆及磁化盘肠管由汝铁硼永磁材料与磁性不锈 钢 板按比例配制，矿化层由麦饭石烧结球组 成，过滤层由导电 纤维配制。该发明能广泛用于 各种酒类、 饮料、酱油、醋等发酵后需贮存自 然 老熟的流体饮料食品，具有高效、安全、 卫生、 自动化程度高等优点。 ４ 、澄清新工艺 硅藻土助滤剂和支撑板过滤系统是食品饮 料过滤中的传统方法， 上世纪７ 年代末， ０ 膜过 滤系统开始使用，８ 年代中期， Ｏ 错流技术被应 用于葡萄酒行业来代替硅藻土粗滤及纸板和圆 盘精滤。 继王朝之后，华夏葡萄酒公司 也于 ２０ ０２ 年底引进了德国Ｓ Ｒ Ｏ Ｒ Ｕ Ａ Ｔ — Ｉ Ｓ公司的大型葡 萄酒错流过滤设备。动态过滤又称错流过滤，循 环泵产生的切线力使未滤液在膜表面形成强烈 的湍流效果， 使滤液透过膜， 浑浊颗粒物质被截 流并冲走，不会在膜表面积累，避免了形成滤 饼，阻塞膜孔， 保证了 通量不会大幅度下降。与 静态过滤相比，其 Ｌ 径更小 ， 可达到微滤效果， 而且其结垢倾向较低，通量下降 趋势相对较小， 适用于较大规模的应用。对过滤料液的悬浮粒 子大小、浓度没有要求，可过滤固 性物含量多的 液体。 刘淑华发明了一种解决果酒沉淀的方法， 采用糖浆作为澄清剂进行下胶，其具体过程是， 在配置果酒的 化糖工序中，将糖浆充分煮沸。静 止至少 ｌｈ ｌ ，是糖浆自然冷却，温度不低于３ ０ ℃， 加入酒中，过滤至澄清。这种方法不改变原 果酒工艺流程，对果酒的品质．口味无任何影 响， 果香味保持完整，放置数年或一 ０ ３℃以下仍 不浑浊。 ５ 、果酒与啤酒工艺结合 啤酒在我国深受广大消费者的喜爱，将啤 酒和果酒的酿造工艺相结合，生产出既具有啤 酒清爽的口感，又具有果酒特殊香味的果啤酒。 果啤酒的生产工艺主要有３种，一种是果汁与 ， 麦芽汁共同发酵生产果啤，一种是果酒与啤酒 勾兑生产果啤酒 ，第三种是在啤酒 中添加果汁 及其他调味剂调配而成。史经略研究了蓝莓啤 酒的生产工艺，将冷却后的麦汁 泵人发酵罐，添 加活化后的啤 酒干酵母菌，添加量为０５ ．％。满 罐后２ｈ ６ 各排１ ４ 和３ｈ 次冷凝固物。起发温度为

诱变育种
物理因子： 物理因子：UV 、X、 γ 、快中子 、高温 等； 化学因子：亚硝酸、NTG、硫酸二乙酯、 化学因子：亚硝酸、NTG、硫酸二乙酯、甲基磺 酸乙酯、 氨基尿嘧啶等； 酸乙酯、5-氨基尿嘧啶等； 对工业用酵母菌细胞进行诱变处理，依据需要， 对工业用酵母菌细胞进行诱变处理，依据需要， 筛选具有优良特性的工业用酵母菌种。 筛选具有优良特性的工业用酵母菌种。
酵母菌育种研究及应用前景
殷文政
前
言
酵母菌与人类的关系源远流长，8000年前 年前， 酵母菌与人类的关系源远流长，8000年前，人们利用酵母菌制作面 酿造葡萄酒、啤酒和清酒等。20世纪末 世纪末， 包、酿造葡萄酒、啤酒和清酒等。20世纪末，酵母菌已作为一种模式生 物在生物化学、 遗传学和分子生物学等方面担任了重要的角色。 物在生物化学 、 遗传学和分子生物学等方面担任了重要的角色 。 自从 1978年建立酵母菌遗传转化技术以来， 1978年建立酵母菌遗传转化技术以来，酵母菌已成为生产异源蛋白及其 年建立酵母菌遗传转化技术以来 生物学分析方面最有用的真核微生物。 生物学分析方面最有用的真核微生物。酵母菌的生物学研究取得了巨大 的进展：1996年完成了酿酒酵母菌全基因组的序列测定。已建立了相关 年完成了酿酒酵母菌全基因组的序列测定。 的进展：1996年完成了酿酒酵母菌全基因组的序列测定 的数据库， 如酿酒酵母基因组数据库（ SGD） 的数据库 ， 如酿酒酵母基因组数据库 （ SGD ） ， 酵母蛋白质组数据库 YPD） 数据库容纳了有关酵母菌的6000多个基因及其蛋白质功能、 6000多个基因及其蛋白质功能 （ YPD ） 等，数据库容纳了有关酵母菌的 6000 多个基因及其蛋白质功能、 结构和相互间的关系等大量信息。 结构和相互间的关系等大量信息。 随着酵母菌的生物学研究的深入发展， 随着酵母菌的生物学研究的深入发展，对酵母菌的应用开发研究及 优良酵母菌的选育也一直倍受关注， 优良酵母菌的选育也一直倍受关注，已有众多的具有不同优良特性的酵 母菌株问世，并造福于人类。 母菌株问世，并造福于人类。本文简要概述工业用酵母菌的育种研究概 况及应用前景。 况及应用前景。

网上：产朊假丝酵母网：酵母形态观察毕赤酵母网：1600倍放大,可看出此酵母菌大小和红细胞差不多我：我的酵母也同样存在这种一个是内部复杂的结构，一个是内部像鸡蛋一样的简单结构的2种酵母形态，我特别想知道，他们究竟是同一种酵母？还是不同的酵母？？后来查到这是一个测试过滤脏水能为能饮用的水的野外微型过滤器的效果，所以，这个酵母菌的不是培养出来的，而是过滤到的，应该是混合菌。

不是纯培养。

一些酵母只有图二的形态，另一些则在单细胞酵母和多细胞细丝状形态之间变化。

事实上，酿酒酵母在恶劣的繁殖条件下也会变成长丝状以便更好的吸收营养。

酵母到底是什么？2013-09-19 08:49 来源：光明网-国际观察频道我有话说图三是白假丝酵母菌，分别有酵母和细丝两种形态：图三，白色念珠菌，也称白假丝酵母菌简而言之，酵母是一种生存状态的别名，而非“鸟类”和“脊椎动物”这种严格的分类法。

1500种真菌在漫长的相似的环境下逐渐获得了类似的生存形态。

这称为趋同进化，是生物学主要的课题之一。

酵母通过不断萌芽来繁殖，比如酿酒酵母此时看起来就像一个鼓囊囊的气球。

图四展示了酵母萌芽：酵母菌可以漂浮在空气中或落在地球上所有表面。

比如一罐打开一段时间的奶油（表面会形奶油色菌落）或者葡萄表面，鲜榨葡萄汁晾着不久便能散发酒味，这也解释了第一杯葡萄酒如何得来。

酵母之所以能制作面包、啤酒和葡萄酒，是因为它可以在无氧环境下利用糖的能量发酵。

发酵产生2个副产品：二氧化碳——使面包鼓起、啤酒充满泡沫；乙醇——赋予啤酒或葡萄酒令人愉悦的口感（制作面包时则会蒸发）。

此过程对这三种食物都非常必要；联想到最初在发霉的小麦堆里闻到了诱人酒香，这也算是微生物赠与人类的大礼。

如今它的身影常出现在热烤箱和食物发酵积液里。

我们几乎可以肯定，若没有酵母革命性的生产，人类食物的历史将彻底改样。

（编译：崔浩）附图1 白色念珠菌-酵母美图酵母菌好实沃全球领先的稳定化耐高温乳酸菌供应商此为糖尿病患者的尿液,沈渣中可看到大量的酵母菌,白血球和细菌...白色念珠菌-第一节白假丝酵母菌Cnki上面查的：放大12000倍的正常热带假丝酵母菌形态图片来源：魏娟. 秸秆醋液抑菌和杀菌性能的研究, 2009>>查看本文图片摘要图片关键词：形态热带假丝酵母菌醋液菌体玉米秆所属学科：有机化工图片上下文：图5-1 放大12000 倍的正常白色念珠菌形态图5-2 放大12000 倍的醋液作用过的白色念珠菌形态Fig.5-1 Normal morphology of C. albicans Fig.5-2 The morphology of C. albicansaffe....>>展开全部∙季军远. 降氰真菌的筛选及其降氰特性研究, 2005>>查看本文图片摘要图片关键词：模式图模式图所属学科：环境科学与资源利用∙图片上下文：图.37酵母菌形态模式图Hahaha ha哈啊哈哈！！我操！真的找到这样的酵母菌了！！！降解氰化物！！∙图片来源：吕丹凤. 基于图像的酵母菌生长分析与筛选技术研究, 2012>>查看本文图片摘要沈楠,肖冬光,吴帅,丁书美,徐曼. 大豆脂肪酸对酿酒酵母酒精耐性的影响, 酿酒科技, 2006 (11). >>查看本文图片摘要图片关键词：沈楠,肖冬光,吴帅,丁书美,徐曼. 大豆脂肪酸对酿酒酵母酒精耐性的影响, 酿酒科技, 2006 (11孙万儒. 酵母菌, 生物学通报, 2007 (11).刘磊,吴晖,刘冬梅,余以刚,李晓凤. 黄酒生产用酵母的分离与筛选, 现代食品科技, 2007 (图片关键词：显微镜细胞形态结论酵母发酵力抗高温这张照片貌似也是两种不同的酵母，颜色深浅不一图274号酵母菌菌落形态及显微形态图263号酵母菌菌落形态及显微形态余翔. 金华火腿现代化发酵工艺中微生物区系研究, 2005>>查看本文图片摘要图片关键词：显微形态菌落形态酵母菌豆芽汁培养基显微形态菌落形态菌落菌体所属学科：轻工业手工业高玲美. 高蛋白海洋酵母的初步研究, 2007>>查看本文图片摘要王麟. 海洋酵母菌种资源库的建立及特殊类型海洋酵母菌的多样性研究, 2008普洱茶中分离的酵母方祥,陈栋,李晶晶,赵超艺,李斌,黄国资,陈忠正. 普洱茶不同贮藏时期微生物种群的鉴定,现代食品科技, 2008 (02)酵母细胞由酵母转化为真菌丝的过程及真菌丝结构吕文洲,刘英,陈和平,朱建林. 氮对酵母菌-SBR系统效能及酵母形态的影响研究, 环境科学, 2008 (05).聚胺酸修饰酵母的扫描电镜的图片许彬彬,佟蜜,孙小梅,李步海. 聚胺酸修饰酵母对碱性品红和亚甲基蓝的吸附行为, 化学工程师, 2008 (06克鲁维毕赤氏酵母42 自然发酵前期的相关酵母本试验发酵第 1 天所筛选的酵母在WL 培养基李梓,王军. 山葡萄酵母菌株的分离及初步鉴定, 食品科技, 2008 (09裂殖酵母在WL培养基上的菌落形态刘树文,王玉霞,陶怀泉,车兆虹,武胜叶. SO_2和酒精处理对葡萄酒自然发酵酵母菌群的影响, 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2008 (05).冬虫夏草子实体梁宗琦,韩燕峰,梁建东,董旋,杜文. 冬虫夏草Ophiocordycepssinensis研究中几个值得关注的问题, 微生物学通报, 2010 (11).次甲基蓝染色后的部分酵母菌株细胞显微形态∙徐勇. 木糖代谢关键酶基因克隆及重组酵母菌株构建, 2005类酵母细胞形态的演化∙段效辉. 普鲁兰多糖高产菌株Y68多糖发酵生产及其机理初步研究, 2007固定化酵母的选育及在木薯浓醪发酵生产燃料乙醇中的性能对比伍彦华,覃红梅,崔师泰,盘柳萍,凌成金. 固定化酵母的选育及在木薯浓醪发酵生产燃料乙醇中的性能对比, 酿酒科技, 2010 (07).驯化前后菌株形态比较周稳稳,张永奎,邹文婷,李永红. 圆红冬孢酵母在酒精废水中发酵产油, 化工进展, 2010 (S1又一个环境微生物！菌落形态龚方. 海洋季也蒙毕赤酵母菊粉酶的发酵生产、纯化、特性、基因克隆与表达的研究, 2008海洋嗜杀酵母的菌落形态海洋酵母G7a菌落形态图(A)与细胞形态图(B)海洋嗜杀酵母的细胞形态（1000倍Olympus相差镜头）嗜杀是指拮抗性较强，与其他物种不混生，产生抗生素的性能王麟. 海洋酵母菌种资源库的建立及特殊类型海洋酵母菌的多样性研究, 2008产香酵母51.53菌株个体形态特征图3一12产香酵母515.3菌株菌落形态特征张翠英. 优良果酒酵母的分离选育及发酵性能研究, 2006白念珠菌生物膜在h2时的镜下形态特点(X40)马海丽. 念珠菌致病机制的研究, 2006酵母细胞冷处理细胞核电镜观察箭头所指细胞核形态异常叶岚. 抗凋亡基因抑制酵母冷诱导的细胞凋亡及其调控机制, 2006DissoconiummultiseptataeA-B分生孢子;C-D分生孢子梗及疤痕Fig.3-9DissoconiummultiseptataeA-Bconidia;C-Dconidiophoresandscars∙图片来源：翟晓茹. 苹果果实表皮生态位点病原菌多样性研究, 2008>>查看本文图片摘要图片关键词：生活史疤痕分生孢子梗分生孢子所属学科：植物保护园艺∙图片上下文：32图3-9 DissoconiummultiseptataeA-B 分生孢子;C-D 分生孢子梗及疤痕Fig.3-9 DissoconiummultiseptataeA-B conidia; C-D conidiophores and scars3.4.3 出芽短梗霉属该....显微镜图片(放大1000倍)显微镜图（放大1000倍）佟蜜. 面包酵母的修饰表征及对重金属和染料吸附行为的研究, 2007酶解前（A）和酶解后（B）的酿酒酵母显微形态成志远. 大豆异黄酮转化菌株原生质体制备与融合研究, 2010康氏木霉孢子形态图(100×10)白晓青. 康氏木霉与酿酒酵母原生质体融合构建产酒精新菌株, 2010假丝酵母原生菌菌落形态高鹤. 脂肪酶产生菌的细胞融合选育及其产酶条件优化, 2010酵母形态生长的共生菌菌落研究一下这篇文章，看看，是不是有的微生物培养就很难纯培养？？邱振鲁. 石耳科真菌的分离培养及其生物活性的研究, 20114 株酵母菌菌株的镜检结果(100 ×)∙聂凌鸿,樊璐,季方. 大曲中细菌和酵母菌的分离及其Biolog微生物系统分析鉴定, 安徽农业科学, 2012 (02菌株HRZ002的菌落形态∙黄蓉姿. 造纸废水生化处理系统中纤维素降解菌的活性特征研究, 2012扣囊复膜酵母A11和敲除菌株A11-a的菌落及细胞形态王东升. 扣囊复膜酵母A11菌株酸性蛋白酶基因和MIG1基因敲除对酶的生产和海藻积累的影响, 2011酿酒酵母细胞（A）和糠醛耐受酿酒酵母细胞(B)的细胞形态（50X）林凤鸣. 糠醛和苯酚对酵母作用定量蛋白质组学及脂肪酸模块构建, 2011添加Phe0H对Y4#菌培养1od时细胞形态的影响武双. 真菌群体感应分子调控产油酵母的研究, 2008菌株WC43-3.菌落形态图（A）与细胞形态图（B）王致鹏. 汉逊德巴利酵母WC43-3菌株内β-1，3-葡聚糖酶及其基因的研究, 2011海洋酒精酵母菌株2E00558的菌落形态和细胞形态赵新灵. 海洋酒精酵母菌的筛选及酒精酵母菌W0的遗传改造, 2011酿酒酵母（a）及单倍体细胞（b）培养7d后产孢情况（看来这里用到了孢子的染色技术）宋保平. 产甘油假丝酵母生理生化特性、倍性及不同碳源发酵代谢的研究, 2012产甘油假丝酵母形态特征宋保平. 产甘油假丝酵母生理生化特性、倍性及不同碳源发酵代谢的研究, 2012酵母菌ZF －2 分离株的形态学特征A: 菌落; B: 细胞( × 400) ; C: 细胞( × 1000)胡秀彩,戚冰洁,顾丹,梁爽,吕爱军. 斑马鱼肠道中一株红酵母(Rhodotorula)的分离与鉴定, 生物技术, 2011 (04在显微镜放大1600倍得到的S酵母形态图在显微镜放大moo倍得到的T酵母形态图蔡金星. 酱油酿造酵母纯化、生长特性及初步应用研究, 2005柱状假丝酵母形态观察（10×40倍）∙滕宏飞. 固定化酵母细胞制备甘油酯型鱼油, 2011菌株CCNWHX13-160T扫描电镜照片∙郭军康. 铅锌尾矿抗重金属放线菌的分离筛选鉴定, 2008酿酒酵母形态∙江丹. 造纸污泥同步糖化发酵产乙醇的研究, 2010上面酵母形态∙于爱红. 控制上面发酵小麦啤酒中高级醇和乙醛含量的研究, 2011霍方珍. 抗盐酸克伦特罗单链抗体的高效表达及免疫学活性研究, 2007酵母形态显微摄影（600×）∙魏运平. 低产高级醇猕猴桃酒酵母菌株的筛选, 2004F16对猕猴桃汁中野生酵母的嗜杀作用Figure7-4killeractivityoffusantF16towildyeastinkiwifruitjuice罗安伟. 猕猴桃酒生香嗜杀酵母的选育, 2012近十来年，我国猕猴桃酒生产得到了长足发展。

微生物学大实验实验指导编者：生物技术教研室2007.3目录实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究实验一酵母菌的培养与分离一、实验目的学习培养和分离酵母菌的技术和方法二、基本原理大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。

酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。

利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。

三、实验主要内容和要求（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括：1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。

2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。

3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。

4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。

四、实验的准备1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。

2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。

配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。

酵母菌-中文百科酵母菌提起酵母菌这个名称，也许有人不太熟悉，但实际上人们几乎天天都在享受着酵母菌的好处。

我们每天吃的面包和馒头就是有酵母菌的参与制成的；我们喝的啤酒也离不开酵母菌的贡献。

酵母菌是人类实践中应用比较早的一类微生物，我国古代劳动人民就利用酵母菌酿酒。

酵母菌的细胞里含有丰富的蛋白质和维生素，所以也可以做成高级营养品添加到食品中，或用作饲养动物的高级饲料。

酵母菌在自然界中分布很广，尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长，例如，在水果、蔬菜、花蜜的表面和在果园土壤中最为常见。

酵母菌简介酵母菌形态图酵母菌（yeast）是一群单细胞的真核微生物。

酵母菌是个通俗名称，是以芽殖或裂殖来进行无性繁殖的单细胞真菌的通称，以与霉菌区分开。

极少数种可产生子囊孢子进行有性繁殖。

酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸性环境，如各种水果的表皮、发酵的果汁、蔬菜、花蜜、植物叶面、菜园果园土壤和酒曲中。

它们多为腐生菌，少数为寄生菌，能引起人和植物的病害，有的酵母菌可与昆虫共生。

酵母菌与人类的关系密切，是工业上最重要，应用最广泛的一类微生物，在酿造、食品、医药工业等方面占有重要地位。

可用来制面包；发酵生产酒精和含酒精的饮料，如啤酒、葡萄酒和白酒；生产食品工业的酶，如蔗糖酶，半乳糖苷酶；也可用来提取核苷酸、麦角甾醇、辅酶A、细胞色素C、凝血质和维生素等生化药物；酵母菌细胞蛋白质含量高达细胞干重的50%，并含有人体必需的氨基酸，因此酵母菌可用于生产饲用、食用和药物的单细胞蛋白（SCP, single cell protein）。

有的酵母菌还具有氧化石蜡降低石油凝固点的作用，或者以烃类为原料发酵制取柠檬酸、反丁烯二酸、脂肪酸、甘油、甘露醇、酒精等。

酵母菌属单细胞真核生物，与高等动、植物的单个细胞相比，具有基本相同的细胞结构，但由于酵母菌具有世代时间短，可在简单的培养基上生长，单个细胞能完成全部生命活动，能获得各个生长阶段的细胞等特点，用其进行细胞学研究比用多细胞真核生物容易得多，因此在分子生物学、分子遗传学等重要理论研究中具有特殊的研究价值。

（8）毕赤酵母属（Pichia ）
代表种为粉状毕赤酵母（P. farinosa）； 常引起泡菜、啤酒和乳制品的变质； 能耐高酒精度使之氧化，酿酒工业的有害菌； 生产SCP； 生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露聚糖等。
（9）克鲁维酵母属（Kluyveromyces ）
能产生β-半乳糖苷酶，能发酵乳糖产生乙醇→以牛乳为原料生产牛乳 酒（马克斯克鲁维酵母/K. marxianus）；
2. 霉菌在酱类制造中的应用
（1）酱类制造涉及的微生物 霉菌：米曲霉（分泌蛋白酶、淀粉酶
和谷氨酰胺酶） 酵母菌：鲁氏接合酵母（耐盐） 细菌：嗜盐四联球菌，鸡葡萄球菌，
耐盐乳酸菌 （2）PCR-DGGE技术 聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳 全面展示样品中存在的核酸种类，反
映出样品中的全部微生物。
产草酸、乳酸、琥珀酸和甘油等。
（二）霉菌与食品酿造 1. 霉菌在柠檬酸生产中的应用 （1）柠檬酸发酵工艺：液体深层发酵法 （2）柠檬酸发酵微生物 目前，采用糖质原料生产柠檬酸的菌株均为 黑曲霉。 微生物代谢积累柠檬酸的发酵机制：三羧酸 循环学说 代谢调控：柠檬酸合酶活性提高，而乌头酸 水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性降低。
（二）生活史：上代个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部 过程，称为该生物的生活史或生命周期。
1.单双倍体型生活史
以酿酒酵母为代表，在产生子囊 孢子培养基上会形成1-4个子囊孢子， 所以会以单倍体形式存在；在单倍体 细胞接触时，经质配和核配产生双倍 体细胞。
2.单倍体生活史
以八孢裂殖酵母为代表，双倍体世 代存在实践通常很短，仅在两个单倍体 细胞和它们的核接合之后，以接合子形 式存在。
游动孢子
厚垣孢子
接合孢子

如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原 核生物表达系统， 核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核 生物表达系统。 生物表达系统。
2、酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， ① 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚， 遗传操作简便； 遗传操作简便； ② 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工 系统； 系统； 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、 ③ 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、 成本低廉； 成本低廉； 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； ④ 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA FDA认 ⑤ 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认 定为安全的基因工程受体系统（ 定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）； ）； 酵母菌是最简单的真核模式生物。 ⑥ 酵母菌是最简单的真核模式生物。
选择标记
对应于营养缺陷型受体的野生型基因：HIS4 (组氨醇脱 对应于营养缺陷型受体的野生型基因： 氢酶基因) 精氨酸合成酶基因)； 氢酶基因)；ARG4(精氨酸合成酶基因 ；TRP1(色氨酸 精氨酸合成酶基因 色氨酸 合成酶基因)； 尿嘧啶合成酶基因) 合成酶基因 ；URA3 (尿嘧啶合成酶基因)。 抗性选择标记：抗生素G418抗性基因和Zeocin G418抗性基因和Zeocin抗性基因 抗性选择标记：抗生素G418抗性基因和Zeocin抗性基因
2、酿酒酵母的附加型载体
pUC质粒的复制起点和amp pUC质粒的复制起点和ampr抗性基因 质粒的复制起点和 酵母菌的2μm质粒的复制区 酵母菌的2μm质粒的复制区 酵母转化的选择元件： 酵母转化的选择元件：LEU2(亮氨酸合成酶基因)； (亮氨酸合成酶基因)