植物叶片中GSH含量测定

植物叶片可溶性蛋白含量测定注意点:1，考马斯亮蓝G-250所配溶液不稳定，所以每次实验都必须新配，且必须新做标准曲线;2，考马斯亮蓝G-250配制完毕，如果发现溶液中有絮状沉淀，可以试用滤纸过滤后使用，如果实验中发现使用过滤后的考马斯亮蓝G-250溶液在与样品接触后短时间内便又发生絮凝，基本上推测该考马斯亮蓝G-250过期(比较容易出现)。

原理植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。

在研究每一种酶的作用时，常以比活(酶活力单位,mg 蛋白)表示酶活力大小及酶制剂纯度。

因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。

常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质浓度范围内(0,100μg/ml)，蛋白质,色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。

试剂(1)牛血清白蛋白配成100μg/ml;(2)考马斯亮蓝G-250:称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。

此溶液在常温下可放置一个月;(3)90%乙醇;(4)磷酸(85%，W/V)。

方法1.标准曲线的绘制(1)0,100μg/ml标准曲线的制作取6支试管，按表28-1数据配制0,100μg/ml血清白蛋白液各1ml。

准确吸取所配各管溶液0.1ml，分别放入10ml 具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2min 后，在595nm下比色，绘制标准曲线。

利用谷胱甘肽检测植物对胁迫的响应机制研究谷胱甘肽（glutathione，简称GSH）是植物中非常重要的一种天然抗氧化物质，可以维持细胞内环境的稳定和正常代谢。

在植物生长发育过程中，GSH不仅可以参与抗氧化防御，还能够调节植物对不利环境的适应性和抗性。

因此，研究植物对胁迫的响应机制，特别是探究GSH在其中的作用，对于揭示植物的适应性和防御机制具有重要意义。

1. GSH代谢途径GSH是由γ-谷氨酰基丙氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸通过GSH合成酶催化而成。

在植物体内，GSH与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）共同参与细胞内环境的维持和代谢调节。

GST是一类含有GSH结合位点的酶，可以通过酰化和S-转移反应将GSH与一些生物活性分子连接起来，形成GSH-S-转移产物，从而将其转化成较为稳定的代谢产物。

同时，GST还能够转移抗氧化的活性物质到GSH分子上，使GSH变成抗氧化物质，从而减轻细胞内环境的氧化压力。

2. GSH在植物抗氧化调节中的作用植物生长发育过程中，GSH与谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽还原酶（GR）共同参与抗氧化修复。

GPx可通过传递电子给H2O2形成活性氧（ROS）的稳定物质，避免ROS进一步损伤细胞内结构和代谢，起到保护作用。

同时，GR则负责GSH还原为glutathione disulfide（GSSG），从而再生能量的GSH，为GPx提供备用的GSH，维持抗氧化修复的持续性。

另外，在环境中存在过氧化物、重金属、盐、温度等胁迫因子时，GSH还可以参与ROS代谢过程中的信号转导，调节植物对不利环境的适应性和抗性。

3. 谷胱甘肽检测技术在胁迫响应研究中的应用近年来，随着GSH测量技术的不断发展，利用高效液相色谱、气相色谱和高分辨质谱等分析技术已经成为植物生理学、分子生物学和细胞生物学等研究领域的重要手段。

其中，利用荧光素-5-硫酸钠（o-phtahlaldehyde）、紫外吸收、液质联用等方法可以定量分析GSH和GSSG的含量，GSH/GSSG比值则被视为反映细胞内氧化还原状态的指标。

A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.75Ca+45.60Cb （2）
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将上式整理，可以得到下式：
Ca=13.95A665- 6.88A649 Cb=24.96A649 – 7.32 A665 CT= Ca + Cb =18.08A649-6.63 A665 CX.C=(1000A470-2.05Ca-114Cb)/245
植物叶绿体色素含量的测定
植物生理生化实验室
1
高
等 植
叶绿素
物
叶绿素b---C55H70O6N4Mg 叶绿素a---C55H72O5N4Mg
叶
绿 体 类胡萝卜 色 素
胡萝卜素---C40H56 叶黄素---C40H56O2Leabharlann 叶绿素吸收光谱：3
类胡萝卜素吸收光谱：
最大吸收区域在蓝 紫光部分（400-500nm）， 基本上不吸收黄光，
1、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否 用这一吸收峰波长进行叶绿素ａ、ｂ的定 量分析？为什么？
2、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80 ％的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无 水丙酮或乙醇提取？
16
7
叶绿体色素的提取
叶绿体色素，不溶于水，易溶
于乙醇、丙酮等有机溶剂。同时，叶
绿体色素在植物细胞内是以色素蛋白 复合体的结构存在的。故通常用80% 的丙酮或95%乙醇提取叶绿素。
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为什么要用含有水的有机溶剂提取叶片 中的叶绿素？
这是因为叶绿素 分子结构的“头部” 是亲水的，与蛋白质 结合很牢，需要经过 水 溶解作用才可被 提取出来。
从而呈现黄色。
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蓝光区
红光区
5
叶绿体色素提取液中各色素的吸收光谱虽有 不同，但又存在着明显的重叠，在不分离的情况 下同时测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓 度 ， 可 分 别 测 定 在 663nm 、 645nm （ 分 别 是 叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）和 475nm的光吸收，然后根据Lambert-Beer定 律，计算出提取液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝 卜素的浓度。

GSH含量的测定主要目的：——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。

主要原理：参照GSH检测分析试剂盒说明书，5,5’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和谷胱甘肽（GSH）反应产生2–硝基–5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG），由于2–硝基–5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘肽（GSH）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。

用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验室签章一、试剂——谷还原性胱甘肽（GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所）二、仪器设备——96孔酶标板——UV-Vis可见多功能酶标仪——旋涡混匀器——离心机——移液枪及其相应量程枪头三、实验方法根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液mL，加试剂一应用液2 mL 混匀，4000 rpm离心10分钟，取上清液1 mL进行显色反应。

2.显色反应：空白管中加入 1 mL试剂一，标准管加入20μmol/LGSH标准液1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液1 mL，然后各管中分别加入 mL试剂二、试剂三、 mL试剂四。

3.混匀，室温静置5分钟后，在412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸取 mL各管反应液加入到新的96孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（OD值）。

4.血清中GSH含量计算公式GSH含量（mg/L）--OD OD=测定OD值空白OD值标准值空白值×标准品浓度（20×10-3mmol/L）×GSH分子量（307）×样本测试前稀释倍数组织中GSH含量公式GSH含量（mg/gprot）--OD OD=测定OD值空白OD值标准值空白值×标准品浓度（20×10-3mmol/L）×GSH分子量（307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度（gprot/L）参考文献Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al.Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.。