化钠法提取虾壳蛋白最佳条件的研究

第２５卷第５期生物学杂志Ｖ０１．２５Ｎｏ．５２００８年１０月ＪＯＵＲＮＡｌ。ＯＦＢＩＯＩ。ＯＧＹＯｃｔ，２００８

氢氧化钠法提取虾壳蛋白最佳条件的研究胡云虎，涂俊芳，郝培应，汪蕾（淮南师范学院化学生物系，淮南２３２００１）

摘要：利用蛋白质的盐析原理对虾壳蛋白进行分离。先分别以氢氧化钠的浓度、反应时间、反应温度作为变量进行单因素分析，并据此结果进行三因素三水平的正交试验分析，确定出提取龙虾壳蛋白质的最佳实验条件为：反应温度１００。Ｃ、氢氧化钠浓度１０％、反应时闻４ｈ，继而在此条件下检验出所提取的蛋白质的纯度为７７．３８％。关键词：虾壳；蛋白质；提取；条件中图分类号：Ｑ５１文献标识码：Ｂ文章编号：１００８－９６３２（２００８）０５—００５８—０３

淡水龙虾，又称龙虾、大龙虾、大红虾、克氏螯虾，学名克氏原螯虾，英名ＲｅｄＳｗａｍｐＣｒａｙｆｉｓｈ或ＲｅｄＳｗａｍｐＣｒａｗｆｉｓｈ，学名Ｐｒｏａｍｂａｒｕｓｅｌａｒｋｉｉ，龙虾在分类上属于甲壳纲Ｃｍｓｔａｃｅａ，十足目ＯｒｄｅｒＤｅｃａｐｅｄａ，爬行亚目Ｒｅｐｔａｎｔｉａ¨１。龙虾体表披一层光滑的坚硬外壳，是宝贵的生物资源，其中含有甲壳素、蛋白质、高级碳酸钙和从其它地方很难得的红色素。虾壳的甲壳质经过加工处理能制成可溶性甲壳素，利用甲壳素可以提取壳聚糖。虾壳经晒干粉碎，还是很好的动物性饲料。本文以龙虾壳为原料，通过单因素实验和正交实验对提取龙虾虾壳蛋白质的最佳条件进行了研究，并对虾壳蛋白质的有效储藏做了一系列的探讨。１材料与方法１．１原料龙虾，２００７年４月购自淮南苏果超市。１．２仪器与试剂主要仪器：ＨＨ—Ｓ数显恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂；ＦＡｌ６０４Ｎ电子天平，上海精密科学仪器有限公司；ＤＧＸ一９０７３ＢＣ一１型鼓风干燥机，上海福玛实验设备有限公司；ＳＨＺ—Ｄ循环水式真空泵，河南巩义市英峪豫华仪器厂；ＫＤＮ一消化炉，上海嘉定仪器厂；ＦＫ一６排风控制器；凯氏定氮蒸馏装置等。主要试剂：乙醇；盐酸；氢氧化钠；高锰酸钾；浓硫酸；硼酸；硫酸钾一硫酸铜粉末［称取８０ｇ硫酸钾和２０ｇ硫酸铜（无水）］。田氏指示剂储存液：取５０ｍＬ０．１％甲烯蓝乙醇溶液与２００ｍＬ０．１％甲基红溶液混合，储存于棕色瓶中备用。此指示剂在ｐＨ值５．２为紫５８收稿日期：２００８—０３—１８；修回日期：２００８—０３—２５作者简介：胡云虎（１９７８一），男，助教。基金项目：淮南师范学院青年教师科学研究项目（２００７１ｋｑ０１）色；ｐＨ值５．４为暗灰色或灰色；ｐＨ值５．６为绿色；变色点为ｐＨ值５．４。分析测定的仪器及试剂均按ＧＢ／Ｔ５００９．１—２００３规定来选择。１．３方法１．３．１脱色脱钙龙虾壳的获取将新鲜的龙虾杀死，取已除去虾肉的龙虾虾壳。将虾壳洗净，用９５％乙醇浸泡２４ｈ使虾壳脱去黄色素，过滤洗净后用５％的盐酸浸泡，使龙虾壳能够完全软化，脱去虾壳中含有的碳酸钙。再次过滤，用蒸馏水洗至中性，在烘干箱中烘干待用。１．３．２龙虾虾壳蛋白质的提取龙虾虾壳蛋白质的提取，参照夏士朋口。和史永昶＂１等方法进行。将一定质量的脱色脱钙烘干的虾壳放人锥形瓶中，用一定浓度的氢氧化钠在一定温度和所需时间下进行脱蛋白质反应，反应结束后，用０．１％高锰酸钾溶液脱去红色素，过滤分离。溶液用盐酸调ｐＨ值５—６，再在溶液中加入近饱和量的氯化钠，蛋白质会渐渐析出。同液分离，固体即为所提取的蛋白质，在８０—９０℃下烘干，称重。１．３．３确定提取龙虾虾壳蛋白质最佳实验条件的单因素影响试验设计首先，各取５ｇ脱色脱钙龙虾壳于三个锥形瓶中，

均加入１００ｍＬ１０％氢氧化钠溶液，分别放在９５℃、１００。Ｃ、１０５℃的恒温水浴锅中进行持续４ｈ的脱蛋白质反应。按前述分离方法获取蛋白质量最高的那组温度即为本次实验所筛选的最佳温度。然后，各取５ｇ脱色脱钙龙虾壳于另三个锥形瓶中，分别加入１００ｍＬ

１０％、１５％、２０％氢氧化钠溶液，均放在１００。Ｃ的恒温水浴锅中进行持续４ｈ的脱蛋白质反应。按前述分离方

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法获取蛋白质量最高的那组氢氧化钠浓度即为本次实验所筛选的最佳氢氧化钠浓度。最后，再各取５ｇ脱色脱钙龙虾壳放入另三个锥形瓶中，均加入１００ｍＬ１０％氢氧化钠溶液放在１００。Ｃ的恒温水浴锅中，分别进行持续４、５、６ｈ的脱蛋白质反应。按前述分离方法获取蛋白质量最高的那组提取时间即为本次实验所筛选的最佳提取时间。每种影响因素实验重复三次。１．３．４确定提取龙虾虾壳蛋白质最佳实验条件的三因素三水平正交试验设计本实验根据多次预备试验的结果选取了反应时间、反应温度及氢氧化钠的质量分数三者进行正交分析，各因素水平如表ｌ所示：表１三因素三水平正交设计表Ｔａｂｌｅ１Ｄ％ｉ卵ｏｆｔｈｅｏ，ｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆｏｒｔｈｒｅｅｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｍｌｅｖｅｌｓ实验按Ａ。Ｂ，Ｃ。、Ａ，Ｂ２Ｃ：、Ａ。Ｂ３Ｃ３等９组进行，按三个因素的水平来提取虾壳内的蛋白质（方法同单因素实验）。正交实验后易得出三因素分别处于何种水平时会出现最佳反应条件，并易得出各因素对提取虾壳蛋白质的影响程度。１．３．５蛋白质纯度的检测利用凯氏定氮法（Ｍｉｃｒｏ—Ｋｊｅｌｄａｔｄ）进行蛋白质含量测定。样品总氮量的计算公式：样品总氮量：丛旦二旦上型型翌竺旦竺×五掣缝熏黧掣一×％“测定时消化液用量（ｍＬ）…。式中，Ｋ为样品滴定时消耗的标准盐酸体积（ｍＬ）；％为空白滴定时消耗的盐酸体积（ｍＥ）；ｃ为０．０１ｍｏｌ／Ｌ标准盐酸的当量浓度；１４为氮的相对分子量；测定时消化液体积为１０ｍＬ；消化液的体积为５０ｍＥ。样品中蛋白质含量（％）＝样品总氮量×６．２５２结果与分析２．１各单因素对龙虾壳蛋白质含量的影响２．１．１温度对龙虾壳蛋白质提取量的影响５ｇ脱色脱钙龙虾壳分别于９５℃、１００。Ｃ、１０５。Ｃ下，以１０％氢氧化钠溶液提取４ｈ。结果如表２所示，不同温度下蛋白质的提取量有显著差异（Ｐ＜０．０５），蛋白质的提取量在１００。Ｃ时达到最大值１．２７６ｇ，温度较低

时或较高时其含量均降低。原因可能是温度较低时，溶液中的蛋白质在碱催化下发生水解的程度增大；而温度过高时，蛋白质容易发生变性。因此本试验中最佳提取温度为１００℃。表２温度对龙虾壳蛋白质提取量的影响Ｔａｂｌｅ２Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｅｘｔｒａｃｔｅｄ

ｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐｓｈｅｌｌ

２．１．２不同浓度的氢氧化钠对龙虾壳蛋白质提取量的影响５ｇ脱色脱钙龙虾壳于１００℃下分别以１０％、１５％

、２０％氢氧化钠溶液提取４ｈ。结果如表３所示，氢氧化钠溶液浓度的变化影响到了蛋白质的提取量。当氢氧化钠浓度为１０％时，提取量最高达１．２８０ｇ（Ｐ＜

０．０５），随后随着氢氧化钠浓度的增大而降低。可能是因为碱浓度过大时。溶液中的蛋白质在碱催化下发生水解，生成了游离的氨基酸，氨基酸在盐析时仍然留在溶液中，所以蛋白质质量减少了，因此本试验中提取蛋白质的最佳氢氧化钠浓度是１０％。表３不同浓度的氢氢化钠对龙虾壳蛋白质提取■的影响Ｔａｂｌｅ３ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＮａＯＨｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓ

ｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐｓｈｅｕ

表４反应时间对龙虾壳蛋白质提取量的影响Ｔａｂｌｅ４Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｅｄ

ｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐ

ｓｈｅｌｌ

２．１．３反应时间对龙虾壳蛋白质提取量的影响将５ｇ脱色脱钙龙虾壳于１００。Ｃ下以１０％氢氧化钠溶液分别提取４、５、６ｈ，实验结果如表４所示，当氢氧化钠浓度与反应温度一定时，反应时间不同，蛋白质的提取量也不同（Ｐ＜０．０５），当反应时间为４ｈ时，提取量最高为１．２７６ｇ（Ｐ＜０．０５），然后随时间的增加而

减少。原因可能是由于时间过长时，蛋白质在碱的催化作用下水解程度增加。因此筛选反应时间为４ｈ。

２．２正交实验所确定的最佳提取条件从表５中可以看出，Ｒ（反应温度）＞Ｒ（反应时５９

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间）＞Ｒ（氢氧化钠浓度），说明相比较而言，反应温度对蛋白质提取量影响最大，反应时间次之，氢氧化钠浓度对其影响最弱。直接比较９组数据结果，可见序号２（Ａ．Ｂ：Ｃ：）提取的虾壳蛋白质质量最大，为１．２１８ｇ（Ｐ＜０．０５）。裹５正交实验下龙虾壳蛋白质提取量Ｔａｂｌｅ５ＰｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐｓｈｅｆｉｂｙｏＲｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ序号“７（）（℃）浓度（％）…”““。”７…””…’４但是根据Ｋ。、Ｋ：、Ｋ３的综合数据，时间栏的Ｋ，、温度栏的Ｋ：、氢氧化钠浓度栏的Ｋ。在平行栏内数据均比其它的大，所以有可能在选定的因素水平表范围内，还存在更好的条件搭配——Ａ，Ｂ：Ｃ，（反应时间４ｈ、反应温度１０００Ｃ、氢氧化钠浓度１０％）。因此，本试验又在其他条件不变的情况下按Ａ。Ｂ２Ｃ。条件设置进行了蛋白质提取，得到蛋白质１．３４１－Ｉ－０．００５ｇ，显著高于上表所列任一条件下所得量（Ｐ＜０．０５），因此，此条件应为本龙虾壳蛋白质提取试验的最佳条件，此结果与单因素影响试验结果一致。２．３凯氏定氮法测定虾壳蛋白质纯度在上述确定的蛋白质较佳提取条件下，用凯氏定氮法对已提虾壳蛋白质的纯度进行了测定，实验结果见表６。由表６可得最佳提取条件下所提虾壳蛋白质的平均纯度为７７．３８％，表明此法提取的蛋白质纯度已达到相当高的水平，具有一定的应用价值。表６最佳蛋白质提取条件下所提虾壳蛋白质纯度Ｔａｂｌｅ６Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｔｙｕｎｄｅｒｏｐｔｉｍａｌｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

３结论３．１以氢氧化钠为主要试剂提取龙虾虾壳中蛋白质

的方法简单易控制，具有良好的开发前景。３．２本试验中从龙虾虾壳中提取蛋白质的最佳反应条件是：反应温度１００。Ｃ、氢氧化钠浓度１０％、反应时间４ｈ，其中反应温度对蛋白质提取量影响最大，反应时间次之，氢氧化钠浓度对其影响最弱。３．３在上述最佳反应条件下提取的蛋白质纯度已达到７７．３８％，说明本试验所确定的最佳反应条件具有一定的应用价值，值得推广。

参考文献：［１】高翔，王蕊．龙虾副产品开发利用研究进展［Ｊ】．江苏食品与发酵，２００７，（４）：１０—１３．［２］夏士朋．克氏原螯虾虾壳中类脂和蛋白质的提取方法［Ｊ］．水产科技情报，２００３，３０（６）：２７０—２７１．［３】史永昶，姜涌明．虾头蛋白质的提取及营养分析［Ｊ］．江苏农学院学报，１９９６，（３）：６２—６３．