凝胶层析.

第七章凝胶层析凝胶层析的别名很多，如分子筛层析、凝胶扩散层析、排阻层析、限制扩散层析等。

它是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析（色谱）方法。

凝胶层析第一节凝胶层析的基本原理第二节凝胶的结构和性质第三节凝胶层析的实验条件和操作第四节色谱峰变宽的问题第五节凝胶层析的应用第一节凝胶层析的基本原理凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质（交联聚苯乙烯，多孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等）填料的柱中进行的。

柱的总体积为V A，它包括填料的骨架体积V GM，填料的孔体积V i(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水体积）。

V A=V1+V0+V GM原理当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。

V e=V0+V i K这里V e是淋出体积，V0是粒间体积，V i K是对某种大小的溶质分子来说可以渗透进去的那部分孔体积，K为分配系数。

平衡排除理论当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。

平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。

扩散分离理论溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。

苯乙烯的分子小，扩散速度快，容易在两相之间达到平衡，所以淋出曲线是一个很窄的峰，并且不太受流速的影响。

聚苯乙烯分子大，扩散速度小，在较高流速下两相之间来不及建立平衡，因此淋出曲线变得又宽又斜，淋出曲线呈现出流速依赖性。

流动分离理论多孔填料颗粒，每个孔相当于一个毛细管，管子的排除效应使得有些较大的溶质分子不能进入它，而液体在管子外面的流速大于在管内的流速。

对于那些能够落入管中的较大的分子又由于被流速场集中到管子的中心部分而加快了速度。

较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。

分离过程三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。

首先将样品加入，接着以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。

最先流出的是物质A，A的分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。

其流经体积最小，等于外水体积V0。

最后流出的是物质C，它的分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫做“全渗入”。

流经体积是外水体积与内水体积之和V0+V i。

物质B的分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中。

这叫作“部分排阻”或“部分渗入”。

它的流径体积V e是全部外水体积加上内水体积的一部分，即V e=V0+K d V iK d称作“排阻系数” 或“分配系数”。

分配系数K d排阻系数：当K d=1时，洗脱体积V e=V0+V i，为全渗入。

当K d=0时，洗脱体积V e=V0，为全排阻。

0＜K d＜1时，洗脱体积V e=V o+K d V i，为部分渗入。

在特殊情况下，某些物质的K d值可以大于1，这是因为该种物质分子与凝胶之间有吸附作用。

小分子物质的K d值却小于1，这是因为有水合作用的存在。

其中包括该物质分子的水合作用，或者是凝胶本身的水合作用。

如对于Sephadex G25（渗入限1000d，排阻限5000d）氯化钠之K d为0.8，葡萄糖的K d为0.9。

物质的K d值凝胶层析的特点（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。

（2）分离效果较好，重复性高。

样品回收率高，接近100%。

（3）分离条件缓和。

（4）应用广泛。

适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化，脱盐、浓缩以及分析测定等。

分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102~105d；Sepharose类为105~108d。

（5）分辨率不高，分离操作较慢。

由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格控制。

第二节凝胶的结构和性质一、葡聚糖凝胶二、修饰葡聚糖凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶四、琼脂糖类凝胶五、多孔玻璃微球六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）一、葡聚糖凝胶商品名为Sephadex G类 .交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖，它是由α-1，6-糖苷链相连着多个D-葡萄糖残基组成的线性分子（少数分枝为1，3-糖苷键，占5%左右）。

再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。

其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。

Sephadex G字母G后的编号为其吸液量（每克干胶膨涨时吸水ml数）的10倍。

如Sephadex G-25每克干胶吸水量为2.5ml。

吸水量小的凝胶，溶涨达到饱和时间短，如Sephadex G-25只须溶涨3h，而吸水大的Sephadex G-100须在常温下溶涨3天才能饱和。

凝胶吸水量的多少间接地反映了凝胶孔径的大小，渗入限和排阻限的大小。

如Sephadex G 50的分离限为1 500~30 000，而Sephadx G 150，达5 000~400 000（蛋白质）。

蛋白质分子为紧缩的椭圆结构。

多糖分子则因为高度亲水，在分子内部固定了大量的水，使其体积比相同分子量的蛋白质分子大。

葡聚糖凝胶性能与交联度的关系聚糖凝胶（G类）的性质聚糖凝胶（G类）特点对稀酸、稀碱和盐溶液稳定。

稳定性随交联度降低而下降。

葡聚糖凝胶含有少量羧基，故对阳离子有轻微的吸附作用。

克服办法是增大离子强度。

芳香族化合物和杂环化合物在葡聚糖凝胶上有时表现出滞留现象，也就使分配系数K d值大于1。

这可能是因为凝胶也有环状结构，氢键或范德华力在起作用。

由于这些非特异的吸附作用的存在，第一次使用的新凝胶柱会吸附少量的蛋白质，使回收率下降，对分离也很不利。

克服的办法是先用一些廉价的、较惰性的蛋白质，如牛血清白蛋白，加以饱和吸附，然后充分洗涤至无蛋白流出，再进行分离操作。

保存保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。

湿法：用过的凝胶洗净后悬浮于蒸馏水或缓冲液中，加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。

常用的防腐剂有0.02%的叠氮化钠、0.02%的三氯叔丁醇、20%乙醇等。

干法：一般是用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶（如20%、40%、60%、80%等），使其脱水收缩，再抽滤除去醇，用60~80℃暖风吹干。

这样得到的干胶颗粒可以在室温下保存。

半缩法：这是以上两法的过渡法。

即用60~70%的乙醇使凝胶部分脱水收缩，然后封口，置4℃冰箱保存。

二、修饰葡聚糖凝胶（一）亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex）骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。

如：Sephadex G-25引入羟丙基即成Sephadex LH-20凝胶。

可以在氯仿、四氢呋喃使用。

它的吸水量下降为2g水/g干胶。

（二）交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex –ion-exchanger）（三）Supperdex系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。

它具有良好的理化稳定性，可在pH3~12范围内使用。

（四）Sephacryl系凝胶是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。

理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。

它可在pH2~11范围内使用。

可分离蛋白质、核酸、多糖乃至病毒颗粒。

三、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是一种全化学合成的人工凝胶。

商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。

该凝胶由丙烯酰胺；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，经四甲基乙二胺催化，聚合而成。

生物凝胶的孔径可以通过调整交联度，即聚合时双体的加入比例（一般1%~25%），以及凝胶总浓度（一般为5%~25%）加以控制。

凝胶总浓度或交联度增加，孔径则减小。

与葡聚糖凝胶相比，生物凝胶的化学稳定性好，可在很宽的pH范围下使用（一般为pH2~11）。

机械强度也好，可在中压下使用并具有很好的流畅度。

因凝胶骨架上没有带电基团，故无非特异吸附现象，有较高分辨率。

生物胶还有一个特点是不为微生物所利用，使用和保存都很方便。

聚丙烯酰胺凝胶的性质商品生物凝胶的编号反映出它的分离界限。

如Bio-Gel P-100，将编号乘以1 000为100 000，正是它的排阻限。

P-10乘以1 000为10 000，接近其排阻限20 000。

四、琼脂糖类凝胶（一）琼脂糖凝胶结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。

琼脂糖凝胶特点琼脂糖凝胶骨架各线形分子间没有共价键的交联。

其结合力仅仅为氢键，键能比较弱。

凝胶孔径依赖于琼脂糖的浓度。

琼脂糖凝胶的化学稳定性较差，一般只能在pH4~9范围内正常使用。

由于琼脂糖凝胶没有带电基团，所以对蛋白质的非特异性吸附力明显低于葡聚糖凝胶。

琼脂糖凝胶的一个很大的特征是分离的分子量范围非常大，大大地超过生物凝胶和葡聚糖凝胶。

琼脂糖凝胶分离范围分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度却随浓度上升而提高。

国内琼脂糖凝胶产品主要有3个规格：琼脂糖凝胶（Sepharose）2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。

（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经1，3-二溴丙醇交联的产品，所以亦称交联琼脂糖凝胶。

它的凝胶孔径均匀，机械强度明显加大。

对热和化学物质的稳定性大大增加。

在pH3~14范围内稳定。

（三）超胶（Utro-gel ACA）所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。

比Sepharose凝胶的化学稳定性好，强度也高，可在pH3~10范围内使用。

商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。

超胶的分离分子量范围介于琼脂糖凝胶与生物胶P之间。

五、多孔玻璃微球多孔玻璃微球的优点是化学稳定性高、强度大，能在高压下操作，并获得好的流速，故实验的重复性很好。

缺点：因有大量的硅羟基存在，对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。

常用聚乙烯二醇浸泡加以钝化后使用。

多孔玻璃微球商品Bio-Glas后面的编号表示其孔径编号越大，分离分子量也越大。

六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）常见的有两大类：聚甲基丙烯酸酯（polymethacrylate）凝胶和聚苯乙烯凝胶（styragel和Bio-Beads S）。

Styragel商品型号有11种，分离分子量范围为1 600～40 000 000。

以二乙苯为介质的悬浮液供应。

生物珠（Bio-Bead S）则以干胶应市，只有三种规格，分离分子量小于2 700，只适于分离分子量较小的物质。

这两类凝胶专用于分离不溶水的有机物质。

只能在有机溶剂中操作，凝胶体积不随溶剂而改变。

第三节凝胶层析的实验条件和操作一、凝胶的选择和处理二、凝胶层析柱的设计和制备三、凝胶层析操作四、主要参数测算一、凝胶的选择和处理（一）凝胶的选择生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。