第七章凝胶层析
凝胶层析的别名很多，如分子筛层析、凝胶扩散层析、排阻层析、限制扩散层析等。
它是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析（色谱）方法。
凝胶层析
第一节凝胶层析的基本原理
第二节凝胶的结构和性质
第三节凝胶层析的实验条件和操作
第四节色谱峰变宽的问题
第五节凝胶层析的应用
第一节凝胶层析的基本原理
凝胶层析的分离过程是在装有多孔物质（交联聚苯乙烯，多孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等）填料的柱中进行的。
柱的总体积为V A，它包括填料的骨架体积V GM，填料的孔体积V i(内水体积)以及填料颗粒之间的体积V0（外水体积）。
V A=V1+V0+V GM
原理
当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。
V e=V0+V i K
这里V e是淋出体积，V0是粒间体积，V i K是对某种大小的溶质分子来说可以渗透进去的那部分孔体积，K为分配系数。
平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。
扩散分离理论
溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。苯乙烯的分子小，扩散速度快，容易在两相之间达到平衡，所以淋出曲线是一个很窄的峰，并且不太受流速的影响。
聚苯乙烯分子大，扩散速度小，在较高流速下两相之间来不及建立平衡，因此淋出曲线变得又
宽又斜，淋出曲线呈现出流速依赖性。
流动分离理论
多孔填料颗粒，每个孔相当于一个毛细管，管子的排除效应使得有些较大的溶质分子不能进入它，而液体在管子外面的流速大于在管内的流速。
对于那些能够落入管中的较大的分子又由于被流速场集中到管子的中心部分而加快了速度。
较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进行分离。
分离过程
三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。
首先将样品加入，接着以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。
最先流出的是物质A，A的分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。
最后流出的是物质C，它的分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫做“全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+V i。
物质B的分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中。这叫作“部分排阻”或“部分渗入”。它的流径体积V e是全部外水体积加上内水体积的一部分，即V e=V0+K d V i
K d称作“排阻系数” 或“分配系数”。
分配系数K d
排阻系数：
当K d=1时，洗脱体积V e=V0+V i，为全渗入。
当K d=0时，洗脱体积V e=V0，为全排阻。
0＜K d＜1时，洗脱体积V e=V o+K d V i，为部分渗入。
在特殊情况下，某些物质的K d值可以大于1，这是因为该种物质分子与凝胶之间有吸附作用。小分子物质的K d值却小于1，这是因为有水合作用的存在。其中包括该物质分子的水合作用，或者是凝胶本身的水合作用。
如对于Sephadex G25（渗入限1000d，排阻限5000d）氯化钠之K d为0.8，葡萄糖的K d为0.9。物质的K d值
凝胶层析的特点
（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。
（2）分离效果较好，重复性高。样品回收率高，接近100%。
（3）分离条件缓和。
（4）应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化，脱盐、
浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102~105d；Sepharose类为105~108d。
（5）分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格控制。
第二节凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶
二、修饰葡聚糖凝胶
三、聚丙烯酰胺凝胶
四、琼脂糖类凝胶
五、多孔玻璃微球
六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
一、葡聚糖凝胶
商品名为Sephadex G类 .
交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖，它是由α-1，6-糖苷链相连着多个D-葡萄糖残基组成的线性分子（少数分枝为1，3-糖苷键，占5%左右）。
再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。
其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。
Sephadex G
字母G后的编号为其吸液量（每克干胶膨涨时吸水ml数）的10倍。如Sephadex G-25每克干胶吸水量为2.5ml。
吸水量小的凝胶，溶涨达到饱和时间短，如Sephadex G-25只须溶涨3h，而吸水大的Sephadex G-100须在常温下溶涨3天才能饱和。
凝胶吸水量的多少间接地反映了凝胶孔径的大小，渗入限和排阻限的大小。
如Sephadex G 50的分离限为1 500~30 000，而Sephadx G 150，达5 000~400 000（蛋白质）。蛋白质分子为紧缩的椭圆结构。多糖分子则因为高度亲水，在分子内部固定了大量的水，使其体积比相同分子量的蛋白质分子大。
葡聚糖凝胶性能与交联度的关系
聚糖凝胶（G类）的性质
聚糖凝胶（G类）特点
对稀酸、稀碱和盐溶液稳定。
