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流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法
实验步骤
1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL 500~1000r/min离心5min，弃去培养液。
2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。
3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。
4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。
6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm 的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
最详细的流式细胞仪实验方法流式细胞仪（Flow cytometry）是一种高精度的细胞分析技术，可用于快速鉴定和分离多种类型的细胞。
本文将介绍一种常用的流式细胞仪实验方法，包括样品准备、细胞染色、细胞分析和数据分析等步骤。
一、样品准备1.收集细胞：制备单细胞悬液，如细胞培养物等。
2.细胞计数：使用细胞计数器或血细胞计数板等工具，计算细胞密度。
3. 调整浓度：根据流式细胞仪系统的要求，将细胞悬液的浓度调整至适当的浓度（一般建议在1×10^5至1×10^6个细胞/ ml之间）。
二、细胞染色1.封闭非特异结合位点：为了减少非特异性结合，可使用FBS（胎牛血清）或BSA（牛血清蛋白）等以阻断非特异位点。
2.添加荧光染料：选择合适的染料，如草酰胺（CFSE）、丙酮染料(ATTO)或FITC等。
按照厂家说明书中建议的浓度将染料添加到样品中，好洗脱或者可用来鉴定细胞的抗体，如表面标记、核酸染色剂或功能性抗体。
3.染色溶液：在4°C下孵育细胞悬液至少30分钟（具体时间根据实验需要决定）。
4.洗涤：向样本管中加入足够的缓冲液，使细胞悬液稀释五倍，并离心沉积细胞。
5.弃去上清液：将上清液弃去，然后用足够的缓冲液再次洗涤沉积的细胞。
6.重悬：向样品管中加入适量的缓冲液，使细胞形成合适的细胞密度。
三、设置流式细胞仪1.打开仪器：确保仪器已开启并运行正常，各通道和检测器已连接好，并预热至适当温度。
2.校正：根据仪器的手册，对流式细胞仪进行校正和标定，以确保流式细胞仪的准确性和稳定性。
3.样品管固定：将样品管插入到流式细胞仪中相应的槽中，以确保准确读取。
4.设置参数：在计算机或流式细胞仪仪器的界面上设置所需参数，如细胞个数、细胞染色等。
四、细胞分析1.利用流式细胞仪：启动流式细胞仪软件，并确保硬件与软件连接正常。
2.定位细胞：在细胞分析开始前，调整激光位置和侦测器的灵敏度，以确保对准确获取细胞。
流式细胞仪法用于血小板相关抗体检测和血小板交叉试验许先国;何吉;刘晋辉;洪小珍;金蕾;傅启华;严力行【期刊名称】《中国输血杂志》【年(卷),期】2003(16)3【摘要】目的应用流式细胞仪(FCM)进行血小板相关抗体检测和血小板交叉试验。
方法利用血小板抗体阳性、阴性血清探寻FCM法实验条件,血小板经血清致敏,洗涤后,加入荧光标记鼠抗人IgG反应,由FCM获取和分析。
52人次正常人血清经FCM法检测后,统计界定正常值范围。
1份阳性血清经9个稀释度倍比稀释,分别用FCM法和固相ELISA抗体筛选法检测。
31名临床血小板输注无效患者分别用FCM法和抗原捕获酶免分析法(MACE)进行102人次血小板交叉配合试验。
结果FCM法检测正常值为荧光强度比值R<1.156,9个稀释度的阳性血清检测表明,FCM法最高可检稀释度为86.67,固相ELISA法最高可检稀释度为56.34(抗-HPA)和67.25(抗-HLA)。
102人次血小板交叉结果显示,FCM法和MACE法无显著性差异(P>0.05)。
结论 FCM法可用于血小板相关抗体检测和血小板交叉配血,是一种快速、灵敏的新方法。
【总页数】4页(P161-164)【关键词】流式细胞术;酶联免疫吸附;相关抗体,血小板;血小板/输注无效;血小板【作者】许先国;何吉;刘晋辉;洪小珍;金蕾;傅启华;严力行【作者单位】浙江省血液中心【正文语种】中文【中图分类】R446;R331.143【相关文献】1.血小板特异性抗体、血小板相关抗体、网织血小板联合检测对血小板减少的鉴别诊断 [J], 林丽娥;姚红霞;王述文;杨剑国2.血小板相关抗体检测及血小板交叉配型的临床应用 [J], 王红梅;廖艳秋;朱梅红3.血小板相关抗体检测用于血小板减少症辅助诊断 [J], 关向宏;王家银;孙培玉4.流式细胞仪检测血小板相关抗体的意义 [J], 陈葆国;干灵红;李伯利;罗文达5.用固相红细胞吸附法检测血小板抗体及交叉配合试验的探讨 [J], 韩玉凤;张洪涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞仪的使用方法及相关资料仪器名称：流式细胞仪生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司使用方法：一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。
2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4．如果需要打印，打开打印机电源。
5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。
7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。
二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。
3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。
4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。
本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。
流式细胞仪操作流程流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对单个细胞进行快速、准确的细胞分析和分类。
本文将详细介绍使用流式细胞仪的操作流程。
一、实验准备在进行流式细胞仪实验之前，需要做好以下准备工作：1. 准备样品：收集和准备待分析的细胞样品，确保样品质量符合要求。
处理样品时要注意细胞的保存和处理条件，以避免样品的污染或破坏。
2. 准备反应体系：根据实验的需要，按照标准操作规程制备所需的反应液和缓冲溶液。
3. 检查和校准仪器：在使用流式细胞仪前，需要对仪器进行检查和校准，确保仪器状态良好，获得准确的实验结果。
二、仪器开机和设置1. 打开流式细胞仪电源，并等待仪器启动完成。
2. 进行仪器的初始化设置，包括选择所需的参数和实验模式等。
3. 设置流式细胞仪的激发和检测通道，根据实验需要选择适当的滤光片和荧光探针。
调整激光功率和检测灵敏度，确保后续实验过程中的信号质量。
三、样品加载和检测1. 将样品转移到适当的离心管中，并进行样品标记。
根据实验需要可以使用荧光标记物、抗体等对细胞进行特异标记。
2. 打开流式细胞仪的样品载架，将样品离心管安置在载架上，并将载架插入流式细胞仪的样品槽中。
3. 启动数据采集软件，设置样品参数和实验条件。
选择合适的采集速度和事件数目，确保获得足够的数据。
4. 开始数据采集，点击软件上的“实时运行”按钮，流式细胞仪将开始读取样品中的细胞信息，并将其转化为电子信号。
5. 采集完成后，保存数据并关闭数据采集软件。
四、数据分析1. 导出数据文件：根据实验需要，将采集到的数据文件导出到数据分析软件中进行进一步处理。
2. 进行数据筛选和清洗，去除噪音污染和非特异信号。
3. 根据实验的目的和问题，选择合适的数据分析方法，对细胞数据进行统计学和生物学分析。
4. 生成结果图表：根据数据分析结果，生成合适的图表或图像，用于展示实验结果和研究发现。
5. 结论和讨论：根据数据分析结果，撰写实验结论和讨论，解释实验结果并提出相应的科学推论。
流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。
流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
流式细胞仪的使用流程1. 简介流式细胞仪 (Flow Cytometer) 是一种先进的生物学实验设备，用于检测和分析细胞的形貌、大小、形态、功能和数量等特征。
它可通过流式技术将单个细胞排列成单个的流束，然后通过激光器进行激发和检测，实现对细胞的高通量分析。
本文将介绍使用流式细胞仪的具体使用流程，帮助用户能够正确、高效地操作该设备。
2. 准备工作在正式操作流式细胞仪之前，需要做一些准备工作：2.1 样本准备•从培养皿中取出待分析的细胞，并进行适当的处理，如洗涤、离心等。
•将细胞悬浮液转移至离心管中，并进行适当的离心操作，以获得较为纯净的细胞样本。
2.2 仪器准备•打开流式细胞仪的电源开关，并等待设备启动完成。
•根据实验需要，调整仪器的相关参数，如流速、激发光源、检测通道等。
•准备合适的背景溶液，用于样本的稀释和冲洗。
3. 操作步骤了解了准备工作后，下面将介绍流式细胞仪的具体操作步骤：3.1 样本准备与装载•使用移液器将经过处理的细胞悬浮液取出一定量至样本管中。
•观察样本管中的细胞悬浮液是否均匀分散，如果存在沉淀则轻轻摇晃样本管使之均匀。
3.2 仪器设置•在流式细胞仪的操作界面上设置相应的参数，如流速、激发光源、检测通道等。
•检查仪器的液路系统是否正常工作，如检查液体的流速、流量传感器是否正常等。
3.3 校准仪器•使用已知样本进行仪器的校准。
通常使用亮度微珠进行仪器的调整和刻度。
•在仪器设置界面选择亮度微珠的通道，并进一步设定检测参数以达到最佳校准效果。
3.4 样本测试•将样本管装载至流式细胞仪中的样本架上，确保样本与仪器的光学系统的光路对准。
•启动流式细胞仪，开始测试。
•根据实验需要，选择合适的激发光源和检测通道，进行样本的快速测试。
•在测试过程中，可根据实验需要采集样本的荧光和散射信号，以及其他额外的参数。
3.5 数据分析•测量完成后，通过流式细胞仪软件导出所测细胞的数据文件。
•使用相应的数据分析软件对所测细胞的数据进行分析和解读。
