2.2.1 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备

PMA体外诱导小鼠多能干细胞向心肌细胞的分化李晓莉;丁璐;陈炎;欧东波;曾迪;郑强荪【摘要】目的研究丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)对小鼠诱导多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响,以建立一种高效安全的体外诱导iPSC分化为心肌细胞的实验方法.方法用悬滴法形成拟胚体(EBs),PMA诱导其向心肌细胞定向分化.免疫细胞学标记检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)和α横纹肌辅肌动蛋白(α-actinin)的表达;RT-PCR和q-PCR检测Brachyury,cTnT,MLC2a,NKX2.5和GATA4等mRNA的表达.以添加相应DMSO作为对照组,观察各组出现搏动拟胚体的数量,计算分化比率.结果PMA 诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的最佳浓度为100 nmol/L,此时拟胚体搏动率可达53％,显著高于对照组(12％),且PMA诱导产生的心肌细胞表达多种心肌蛋白及基因,具有心肌细胞的结构特征.结论 PMA能够促进miPSC在体外定向分化为心肌样细胞.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2015(035)004【总页数】7页(P463-469)【关键词】多能干细胞;心肌细胞;丙二醇甲醚醋酸酯;分化【作者】李晓莉;丁璐;陈炎;欧东波;曾迪;郑强荪【作者单位】第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038;第四军医大学唐都医院心血管内科,陕西西安710038【正文语种】中文【中图分类】Q254目前人工生物心脏被认为是一种治疗心脏损伤最有希望的途径和方式，但体外构建人工生物心脏，必须制备大批量、同质性心肌细胞。

原代心肌细胞由于其极低的增殖能力，无法满足大批量制备的要求；而干细胞来源的心肌细胞则成为解决这一难题的最好选择[1]。

鸡胚成纤维细胞（CEF）的制作及细胞培养（一）CEF的制备1. 实验试剂1×DMEM（不含丙酮酸钠）、小牛血清、高压过的PBS、胰酶、双抗。

2. 实验设备和材料酒精灯、酒精喷壶、酒精棉、打火机、计时器、一次性手套废液缸、镊子、细胞瓶、50 mL试管架、50 mL离心管、1000ul 移液枪及枪头、100 uL移液枪及枪头、塑料吸管、一次性培养皿、SPF鸡胚（9-11日龄均可）将3把小镊子、1把剪刀、1个50 mL离心管、1个玻璃培养皿放入一个大号饭盒内；取一中号锥形瓶，瓶口由内到外分别盖上6层纱布、锡箔纸、报纸包好，高压30 min备用。

3. 实验步骤（1）将所用材料放入超净工作台（小牛血清及胰酶除外），紫外照射30 min。

（2）用镊子取出高压过的平皿、镊子，倒入PBS液；（3）酒精消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，置于培养皿中用镊子去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个培养皿中冲洗干净；（4）将胚体置于高压过的50 mL离心管内，略水平放置，用剪刀充分剪碎，越碎越好；（5）加入胰酶（5 mL/个），37℃水浴锅内消化5-8 min，待胚体呈绒毛状即可，吸除消化液；（6）加入30 mL含10%血清的DMEM，充分吹打，静置片刻，过滤至锥形瓶内；（7）重复第六步；（8）分装至培养瓶或将细胞按1.2×106 cells/well传到6孔板中，每孔 2 mL。

（二）细胞冻存（1）倒去细胞上清液，加入PBS洗去残留的培养基，洗两次。

（2）加入0.25%的胰酶，消化10-20 s后倒去。

（3）1瓶细胞加入1 mL培养基吹打均匀，吸入到离心管中。

（4）将细胞离心，1000 rpm，2-3 min。

（5）根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20% FBS+10% DMSO）重悬细胞，一般两瓶细胞冻存三管（FBS越高，细胞复苏时活力越大）。

DMSO一定要配成10%。

显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立 即终止消化
加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打 计数板计数 分瓶培养
细胞的消化传代方法
生长细胞形态
四、作业与思考
1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。 2．细胞培养获得成功的关键要素是什么? 3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。 4．绘制细胞生长曲线图。 5．绘制细胞分裂指数图。
4、金属器材的清洗处理方法 金属器材的清洗处理方法 纸擦去表面的油脂
洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠化传代方法
吸除或倒掉旧培养液
加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉 加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）
肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液 继续作用2～3分钟
分别在5min、15min、20min观察细胞融合
细胞融合
2、PCC诱导和观察
90分钟后离心弃上清 加入0.075mol/lKCl8ml
混匀37℃25分钟 加入1ml固定液混匀离心弃上清
加7ml固定液固定20min 离心弃上清加0.5ml固定液 滴片（冰、高、烤）Giemsa染色12min
水冲、晾干、镜检
细胞工程实验
新乡医学院生命科学实验教学中心
课程组成员：杨慈清 、李虎、王红霞、许重洁
办公电话：3029114
目录
实验一 动物细胞的培养 实验二 细胞融合技术与染色体提前凝集标本制 备实验三 小鼠MEF饲养层的制备 实验四 MS培养基的配制和愈伤组织诱导 实验五 原生质体的分离、纯化和活力鉴定
实验一 动物细胞的培养
显微镜下的培养细胞
三、实验方法
方法
1、玻璃器材的清洗处理方法 2、塑料器材的清洗处理方法 3、橡皮器材的清洗处理方法 4、金属器材的清洗处理方法 5、细胞的消化传代方法

胚胎工程知识点一 体内受精和早期胚胎发育1.精子的发生⎩⎨⎧场所：睾丸的曲细精管时间：初情期→生殖机能衰退过程：2.卵子的发生⎩⎪⎪⎨⎪⎪⎧场所：卵巢、输卵管时间：始于性别分化后(胚胎时期)过程：排卵：指卵子从卵泡中排出3．受精(1)场所： 。

(2)过程①准备阶段：精子 、卵子的准备(发育到 )。

②受精阶段：顶体反应(穿越放射冠)→ (屏障1)→ 作用(屏障2)→雌、雄原核形成，配子结合成受精卵。

(3)卵子受精完成的标志：在透明带和卵黄膜之间观察到 。

4．胚胎发育受精卵→卵裂→桑椹胚→ ⎩⎨⎧滋养层细胞→胎膜和胎盘内细胞团→原肠胚→组织器官的分化知识点二 体外受精和早期胚胎培养 1．体外受精(1) ：促性腺激素、超声波探测仪、内窥镜等。

(2) ⎩⎪⎨⎪⎧采集：假阴道法、手握法、电刺激法获能：培养法、化学诱导法(3)受精：获能的精子和培养成熟的卵子结合形成合子。

2．早期胚胎培养(1)培养液成分： (两盐)， (两素)， (两酸)，水， 。

(2)胚胎去向： 。

三、胚胎工程的应用和前景 1．胚胎移植(1)胚胎来源：转基因、核移植、体外受精、体内受精。

(2)实质：产生胚胎的 和孕育胚胎的 共同繁育后代的过程。

(3)地位：胚胎移植是胚胎工程中最后一道程序，移植的胚胎必须在原肠胚之前，不能直接移植受精卵。

(4)意义：充分发挥 。

2．胚胎分割(1)概念：采用机械方法将早期胚胎分割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

(2)材料：发育良好、形态正常的。

(3)注意事项：。

(4)意义：加快繁殖速度，是动物无性繁殖或克隆的方法之一，其他克隆方法还有核移植。

3．胚胎干细胞(1)有机物：胚胎没有和母体建立联系，没有从母体获取有机物，而一直呼吸消耗，有机物总量减少。

(2)细胞体积：胚胎总体积不变或略有减小，但细胞数目增多，所以每个细胞体积减小。

(3)细胞中DNA含量：伴随细胞分裂，细胞数目增多，总DNA含量增多，但每个细胞中核DNA 含量保持相对稳定。

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。

二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。

培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。

0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。

三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。

用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。

2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。

用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。

3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。

4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。

5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。

6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。

五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。

丝裂霉素C对制备干细胞饲养层效果的影响彭三凤;王利;周学亮;陈美娟;陈东阳;杨小淦;许慧艳;卢晟盛;张明【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2015(046)005【摘要】[目的]筛选出丝裂霉素C制备干细胞饲养层的最佳处理浓度,为建立完善干细胞饲养层培养体系奠定基础.[方法]以STO(SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系)、MEF(原代分离的小鼠胎儿成纤维细胞)和BRL(大鼠肝细胞)为研究对象,分别以0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/mL丝裂霉素C处理汇合度为90％～ 100％的STO、MEF、BRL细胞单层2h,继续培养3d后统计各处理组饲养层细胞的存活数量及增殖细胞比例,并用EdU免疫荧光标记法检测细胞的增殖状况.[结果]随着丝裂霉素C处理浓度的增加,饲养层增殖细胞数量占总细胞数量的比例均呈逐渐降低趋势.丝裂霉素C处理STO、BRL、MEF的最佳浓度分别为5.0、10.0和10.0 μg/mL,对应的增殖细胞比例分别为6.8％、3.0％和2.1％.[结论]丝裂霉素C能有效抑制干细胞饲养层细胞的增殖并保持良好活性,但不同饲养层细胞的最佳处理浓度有所差异.【总页数】6页(P905-910)【作者】彭三凤;王利;周学亮;陈美娟;陈东阳;杨小淦;许慧艳;卢晟盛;张明【作者单位】广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005;广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005;广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005;广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005;广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005;广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005;广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005;广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005;广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广西高校动物繁殖与动物生物技术重点实验室,南宁530005【正文语种】中文【中图分类】Q813.11【相关文献】1.丝裂霉素C对制备干细胞饲养层效果的影响 [J], 彭三凤;王利;周学亮;陈美娟;陈东阳;杨小淦;许慧艳;卢晟盛;张明;卢克焕;陆阳清;2.小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较 [J], 熊吉信;刘小春;杨春江;刘兆轩3.国产丝裂霉素处理的STO细胞作为饲养层培养牛胚胎干细胞 [J], 丛姗;王瑞;郝斐;温建勋;毕兆伟;诺明途;刘东军4.丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响 [J], 郝同杨;陈世豪;张光景;王杏龙5.丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备的影响 [J], 黄奔;石德顺;蒙超衡;杨素芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

的状 态 。 由 于 饲 养 层 细 胞 能 分 泌 白血 病 抑 制 因 子 （ Ｌ Ｉ Ｆ） 等 抑 制 Ｅ Ｓ细 胞 分 化 的 因 子 ， 目前 ， Ｅ Ｓ细 胞 的 培 养 主 要 是 以 饲 养 层 来维 持 其 干细 胞 特 性 。本 实 验 探 讨 了胎 鼠成 纤 维 细 胞 （ ＭＥ Ｆ ） 的分 离 培 养 、 传代 及其 作 为饲 养层 细胞 的处 理条 件 ，
１ ． ３ ＭＥ Ｆ作 为 Ｅ Ｓ饲 养层 的 预 处 理
复苏冻存 的原代或第 １ 代 ＭＥ Ｆ进行培养 ， 根据 所要培养 的Ｅ Ｓ细胞 的多 少传 １ ～２代 以扩增 ＭＥ Ｆ ， 待细胞长满后换上 新培养液 ， 加入丝裂霉素 Ｃ使终浓 度为 １ ０／ ￣ ｇ ／ ｍｌ ， 放回 ３ ７ ￣ Ｃ， ５ ％ｃ （ ） ２ 培养箱 中作用 ３ ｈ 。之 后用 Ｐ Ｂ Ｓ冲洗 ６遍 去除 残余
的丝裂霉 素 ， 再用 ０ ． ０ ５ ％ 胰 酶 一０ ． ０ ２ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ消化， 以 ５× １ Ｏ ／ ｃ 密度接 种于 ０ ． １ 明胶 处 理 过 的 ６ ｅ ｍ Ｄ ｉ ｓ ｈ培 养 ， 待 贴壁后用 于培养 Ｅ Ｓ细 胞 。
胞在体外 培养不仅要保持 其增殖 能力 ， 而且 要维 持其未 分化
维普资讯
ＣＨＩ ＮＥ Ｓ Ｅ Ｊ ＯＵＲＮＡｌ ＯＦ ＡＮＡＴ ＯＭＹ Ｖｏ １ ． ３ ０ Ｎｏ ． ３ ２ ０ ０ ７
解 剖 学 杂志
２ ０ ０ ７ 年第 ３ Ｏ卷 第 ３期
饲 养 层 体 系 的 建 立 与 胚 胎 干 细 胞 的 培 养
１ ． ５ Ｅ Ｓ—Ｓ ８细 胞 的 碱 性 磷 酸 酶 （ ＡＫＰ ） 检 测
Ｅ Ｓ － Ｓ ８细 胞 传 代 培 养 次 日 用 ４ 多 聚 甲 醛 室 温 同 定 １ ５ ｍｉ ｎ ， 取 ２ ０ ０￣ ｇ ／ ｍｌ ａ 一 奈基 磷 酸 钠 ， １ ｍｇ ／ ｍｌ 坚 同蓝 Ｂ盐 ， 溶 解在 ０ ． １ ｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｔｒ ｉ ｓ 缓 冲液 中 ， 孵育 １ ５ ～３ Ｏ ｍｉ ｎ后 倒 置 显 微 镜下观察 。

度分 别 为 １ ．３ ３３ ％和 ９８ ， Ｎ Ｈ３ ３细 胞 波形 蛋 白阳性 率 和平 均 荧 光 密度 分别 为 ２ ．１ ．９ 而 Ｉ Ｔ ８１ ％和 １ ．６ ４１ 。结 论 ： 分离 培 养 的细 胞 具有 成纤 维 细胞 的形态 学特 征 ， 表 达成 纤 维 细胞 的 特征 分子 波 形蛋 白。 并 以组 织块 直 接培 养法 成 功 自新 生小
鼠皮 肤分 离 培养 成 纤维 细胞 ， 建立 肿瘤 体 外模 拟 微环 境 提供 实 验材 料 和研 究基 础 。 为
【 键 词１ 生 小 鼠 ； 纤维 细胞 ； 外 培 养 ； 形蛋 白 关 新 成 体 波
【 中图分 类 号１ ３ ２ １ ９． Ｒ 【 文献 标 识码 】Ａ 【 章编 号】 １ ３ ７ １ ２ １ ）０（ 一 ０ — ４
１Ｄ ｐ ｒ ｎ ｆＲｅｐｒｔｒ ｄｃｎ ，ｔｅ ＦｒｔＡ ｆｉｔｄ Ｈｏｐｔｌｏ ｉｍｅ ｎｖ ｒｉ ，Ｆ ｊ ｎ Ｐｏ ｉｃ，Ｘｉｍ ｎ ． ｅ ａｔ ｔ ｏ ｓｉ ｏｙ Ｍｅｉｉｅ ｈ ｉ ｆｌ ｅ ｓ ｉ ｆＸ ａ ｎ Ｕ ｉｅ ｔ ｕｉ ｒｖｎ ｅ ｍｅ ａ ｓ ｉａ ａ ｓ ｙ ａ ａ ｅ ３ １ ０ ， ｈｎ ； ． ｐ ｒ ｎ ｆＩ ｍｕ ｏｏｙ Ｂ ｓ ｄｃ ｅＳ ｉ ｃ ｎｔｅＭｅ ｉａ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｉｍｅ ｎｖｒｉ ， ｕｉ ６ ０ ３ Ｃ ｉａ ２Ｄｅ ａｔ ｔ ｍｅ ｏ ｍ ｎ ｌｇ， ａｉ Ｍｅ ｉｉ ｃ ｎ ｅｉ ｄｃｌ ｏ ｅ ｅｏ ａ ｎＵ ｉｅ ｔ Ｆ ｊ ｎ ｃ ｎ ｅ ｈ ｌ Ｘ ｓ ｙ ａ
Ｍ ｅｈｏ ：Ｆ ｒｔｙ ｋｎ ｗａ ａ ｅ ｒ ｍ ｅ ｏ ｌｂｃ ｍｉｅ ａ ｄ ｍａ ｅｉ ｔ ｔ ｄｓ ｉｓ ，ｓ ｉ ｓｔｋ ｎ ｆｏ ｎ ｗｂ ｒ Ｂａ ／ ｃ ｎ ｄ ｎｏ １ｍｍ ｔｓｕ ｓｗｉ ｃｓｏ ｓｓｅ ｉ ｌ． ｅ ｏ ｄ ｙ ｌ ｎ ｉｓ ｅ ｔ ｓ ｉｓ ｒ ｔｒｌ ｙ Ｓ ｃ ｎ ｌ， ｈ ｅ

30分钟内高效去除饲养层细胞
要维持小鼠和人的ES 、iPS 的良好生长状态，大多都需要用小鼠的胚胎成纤维细胞做饲养层，如mEF 和NIH3T3细胞。

在初级角质细胞的培养中也常需要饲养层细胞。

但很多下游实验又必须去除饲养层细胞，以保证细胞类型的均一性，传统方法是用沉淀贴壁法或者多次传代稀释法去除饲养层细胞，这两种方法都需要较长时间，而且去除的不完全，会有残留，过程中也会损失目的干细胞，因此去除饲养层细胞是干细胞培养中的一大难题。

而美天旎的饲养层细胞去除试剂盒利用磁珠分选的原理，在30分钟内即可高效去除饲养层细胞，而且不损失目的细胞。

适用于以下实验：
基因表达谱分析
ES 细胞的囊胚注射实验
干细胞的分化发育实验
饲养层细胞去除前 饲养层细胞去除后。

滋养层和饲养层细胞的关系1.滋养层细胞:在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。

聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团inner cell mass，ICM，将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。

所以做基因诊断时，通常取少量滋养层细胞诊断是否患有遗传病，这样不会影响胎儿发育.2.饲养层细胞:在正常机体内，细胞除了获得一些血液来的营养外，还在细胞与细胞之间互换特殊的物质，用于分裂分化和营养等。

因而，在细胞体外培养中，除了正常的培养基外，先培养一层特殊的细胞，然后再在其上接种要实验的细胞，这样更能模拟体内环境。

这些特殊的细胞就是饲养层细胞，通常是成纤维类细胞、输软管表皮细胞。

这些细胞可以提供实验细胞更好的营养，有的分化研究则是必须有饲养层细胞。

饲养层的影响，主要体现在饲养层种类、丝裂霉素处理滋养层的时间、饲养层细胞的代数和饲养层细胞的密度等。

动物种类不同对饲养层种类的要求也不同。

饲养层种类STO PMEF：对各种动物都较适宜，，但最可靠的方法还是根据动物种类筛选最佳饲养层为宜。

有研究表明，PMEF比STO更适合用于小鼠ES胚胎干细胞的培养。

UE子宫上皮细胞BRL大鼠肝细胞等动物种类需要经过筛选来确定最适宜该种动物ES分离克隆的饲养层丝裂霉素处理滋养层的时间目前丝裂霉素常用有丝分裂阻断剂处理时间在小鼠成纤维细胞上一般要求为：在37摄氏度，5%二氧化碳饱和温度的条件下处理24h，时间过短达不到预定目的，成纤维细胞不能被成功地抑制住，时间过长则使细胞老化，活性下降，分泌因子的能力降低，从而直接影响ES细胞增殖和分化的抑制。

同时处理完的清洗工作也很重要，一般要求用无钙镁PBS冲洗4~5遍，以确保丝裂霉素的彻底清除。

饲养层细胞的代数及密度以小鼠成纤维细胞为例，选3~5代，密度为10^6-10^7个/ml为宜，代数过低所含杂细胞太多，代数过高则细胞活力降低。

利用小鼠胚胎干细胞进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧在生物学研究中，利用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，简称mESCs）进行活体动物模型的构建是一项重要的技术手段。

通过这种方法，科研人员可以研究不同疾病的发生机制、治疗方法以及新药的筛选等。

接下来，我们将介绍利用mESCs进行活体动物模型构建的操作步骤和技巧。

首先，需要获取小鼠胚胎干细胞。

通常，科研人员会选择小鼠的早期胚胎作为胚胎干细胞的来源。

在实验室条件下，将小鼠受精卵取出放入培养皿中，培养合适的时长，使其发育到内细胞团阶段。

随后，将内细胞团取出，并经过适当的处理，分离出胚胎干细胞。

接下来，将获得的胚胎干细胞进行扩增。

通过在适当的培养条件下给予合适的培养基和生长因子，可以促进胚胎干细胞的增殖。

这个阶段需要控制好培养基的组分和培养条件，以确保胚胎干细胞的健康生长。

一旦胚胎干细胞经过扩增达到足够数量，就可以开始进行活体动物模型的构建了。

首先，需要选择合适的小鼠品系作为宿主动物。

常用的小鼠品系有裸鼠和免疫缺陷小鼠等。

这些小鼠具有较弱的免疫力，能够更好地接受外源细胞的移植。

将胚胎干细胞进行基因编辑后，将其注射或移植到选择的宿主小鼠体内。

注射的部位可以根据具体实验需要来确定，常见的有皮下注射和体腔注射等。

如果是构建特定器官的模型，可以将胚胎干细胞移植到对应的器官内。

注射或移植完成后，需要对小鼠进行适当的后续处理。

这包括观察小鼠的行为、收集样本进行分析和实验等。

需要注意的是，由于注射或移植过程对小鼠可能产生一定的创伤，因此需要进行必要的护理和监测，确保宿主小鼠的健康状况。

除了基本的操作步骤外，在利用mESCs进行活体动物模型构建的过程中，还有一些技巧和注意事项。

例如，在选择胚胎干细胞时，可以根据实验的需要选择具有特定基因突变的胚胎干细胞，以模拟特定疾病的发生机制。

此外，需要控制合适的细胞数量和注射或移植的时间点，以确保实验的准确性和稳定性。

成体干细胞
➢ 是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种 以上子细胞的未成熟细胞。
➢ 来源于成体组织或器官，一般具有组织特异性， 只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞 或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。
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3、根据干细胞组织发生的名称进行分类:
➢胚胎干细胞 ➢造血干细胞 ➢骨髓间质干细胞 ➢肌肉干细胞 ➢成骨干细胞 ➢内胚层干细胞 ➢视网膜干细胞 ➢胰腺干细胞
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山中伸弥
约翰·伯特兰·格登
（Shinya Yamanaka） （ John Bertrand Gurdon）
2012年的诺贝尔生理学或医学奖获得者
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山中伸弥
1962年出生于日本大阪府，日本医学家， 京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授
人生万事如塞翁失马：高中热衷柔道，受伤了10多次 (骨折)，最后阶段学习，考入国立神户大学医学部； 毕业后，蹩脚的整形外科医生；1989年，进入大阪大 学研究生院，毕业后，前往美国旧金山的格拉斯顿研 究所留学，开始从事老鼠的胚胎干细胞研究。1996年 回国后研究陷入停滞；1999年12月，成为奈良先端 科学技术大学院大学的副教授；2003年，日本科学技 术振兴机构为他提供了为期5年、总额3亿日元的研究 经费，至此逐步走向成功。
1999年12月，干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该年度 世界十大科学进展之首。
2007年日本的Yamanaka研究小组和美国的James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干细胞 （induced pluripotent stem cell，iPS细胞）。
2013年，加州大学旧金山分校的丁盛团队发现了化学诱导多 能干细胞（CiPSCs） 。
无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化 因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基 中加入重组的LIF制备条件培养基。