《分子生物学》实验指导书

《分子生物学》实验指导书

实验学时：32学时 适用专业：生物科学、生

物技术

实验目录

实验一 质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴

定…………..…..1

实验二聚合酶链式反应扩增DNA片

段………………..….3

实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分

子转化…4

实验四 植物基因组DNA提取及电

泳………………………6

实验五植物基因组RNA提取及电泳……………7

实验一 质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定

实验项目类型：综合性

一、实验目的

1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和

方法。

2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内

切酶酶切的原理和方法 ，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键

工具。

二、实验原理

碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线

性染色体DNA的结构差异来实现分离的。在pH12-12.5时，线性DNA被

彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍

会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢

复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠

绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。

三、实验仪器与材料

1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、

EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。

2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、

2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝

25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。

3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇

床、高压蒸汽灭菌锅、 涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像

系统、恒温培养箱、制冰机等。

四、操作步骤

质粒DNA的提取步骤：

1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平

板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃

振荡培养过夜。

2. 将1.5 ml菌液倒入EP管中，7,000 rpm离心2 min。

3. 去掉上清液，沉淀悬于100 µl Solution I 中,室温放置10 min。

4. 加入200 µl Solution II, 混匀，冰浴5 min。

5. 加入150 µl Solution III（冰上预冷）, 混匀，冰浴5 min。

6. 12,000 rpm离心10min，将上清转至另一离心管中。

7. 向上清中加入等体积氯仿（去蛋白），反复混匀，12,000 rpm离

心5min，将上清转移到另一个离心管中。

8. 向上清液中加入预冷的2体积无水乙醇，混匀后，室温放置

5~10min。12,000 rpm离心5min，倒去上清，把离心管倒扣在吸收纸

上，吸干液体。

9. 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，倒去上清，空气中干燥。

10. 加20µl TE缓冲液, 使DNA完全溶解，-20℃保存。

11.电泳检测质粒,在10 µl反应体系中加入8µl质粒DNA，2 µl

10×Loading Buffer, 1%琼脂糖电泳 (5V/cm) 检测。

酶切： 配制如下体系，37℃酶切质粒3 h后，电泳检测酶切结果。

10×K 1μL 质粒DNA 1μL EcoRⅠ/BamHⅠ1μL 无菌水 7μL

五、实验报告

绘出质粒DNA电泳图、酶切电泳图六、思考题

酶液中甘油的用途是什么？

实验二 聚合酶链式反应扩增DNA片段

一、实验目的

通过实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

二、实验原理

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快

速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待

扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退

火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

三、实验仪器与材料

1. 材料： 0.2mlPCR管、离心管架、EB、琼脂糖、吸头等。

2. 溶液或试剂：DNA模板、种dNTP、物1、引物2、Taq酶、DNA相

对分子质量标准物等。

3. 其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高压蒸汽灭菌锅、琼脂

糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、制冰机、PCR仪等。

四、操作步骤

1. 在0.2ml RCR管内配制25ul反应体系：

质粒DNA 1µl 10×buffer 2.5 µl MgCI2 1.5µl dNTP 2µl 引物1 1µl

引物2 1µl Taq酶1µl 无菌水15µl。

2. 在下列条件下进行扩大增

（1） 94℃变性3min

（2） 94℃变性30S

（3） 55 ℃退火30S

（4） 72 ℃延伸30S

（5） 重复2-4共25次

（6） 72 ℃延伸10min

3. 扩增后，电泳检测PCR结果

五、实验报告

绘出PCR电泳图

六、思考题

PCR的原理是什么？

实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化一、实验目的

1. 学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。

2. 学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。

二、实验原理

将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨

胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙

中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受

态；此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复

合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42℃热脉冲处理后，

细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性

增加，DNA分子便趁机进入细胞内。

三、实验仪器与材料

1. 材料： 0.2mlPCR管、离心管架、EB、琼脂糖、吸头等。

2. 溶液或试剂：DNA模板、种dNTP、物1、引物2、Taq酶、DNA相

对分子质量标准物等。

3. 其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高压蒸汽灭菌锅、琼脂

糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、制冰机、PCR仪等。

四、操作步骤

1. 从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的

试管中，37度振荡培养过夜。

2. 取0.5ml菌液转接到一个含有50mL LB 液体培养基锥形瓶中，37

度振荡培养2-3小时。

3. 将菌液转移到1.5 mLEP 中，冰上放置10min。

4. 离心10min（4000r/min），回收细胞。

5. 倒出培养液，将管倒置1min,使培养液流尽。

6.用冰冷的0.1mol/LCaCl2 300μL悬浮沉淀，立即放在冰上保温30

Min。

7.离心10min（4000r/min），回收细胞。

8. 用冰冷的0.1mol/LCaCl2 50μL悬浮细胞（放在冰上）。

9. 取50μL新配制的感受态细胞，加入质粒DNA 2μL混匀，冰上放

置30Min。

同时做两个对照：

受体菌对照：50μL感受态细胞+2μL无菌水

质粒对照：50μL0.1mol/LCaCl2溶液+2μL质粒DNA

10. 将管放到42度循环水浴1-2min。

11. 冰浴2min。12. 每管加200μL LB 液体培养基，37度培养45min。

13. 将250μL转化的感受态细胞涂布在含氨苄青霉素（100μg/mL）

的培养皿中。

14. 倒置平皿37度培养12~16H，出现菌落。

五、实验报告

绘出质粒DNA分子转化结果图

六、思考题

1． 感受态细胞的制备原理？

2． 影响转化率的因素有哪些？

实验四 植物基因组DNA提取及电泳

一、实验目的

1．熟悉常用仪器。

2．学习、掌握植物基因组DNA提取原理、方法和DNA质量检测技

术。

二、实验原理

用液氮研磨植物组织，从而破碎细胞；细胞提取液中的SDS溶解膜

蛋白而破坏细胞膜，并使蛋白质变性沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活

性。再用酚和氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液用乙醇沉

淀。

三、实验仪器与材料

1. 材料： Tris,EDTA,KCl,SDS,NaCl,EB，酚，氯仿，异丙醇，β巯基

乙醇，乙醇，琼脂糖，50ml离心管，研钵、研杵，吸头，液氮，一次性

手套，棉手套等。

2. 溶液或试剂：细胞提取液，5 mol/L KCl，TE等。

3. 其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、高低温离心机，台式

离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温金属浴等。

四、操作步骤

1. 取2g新鲜菠菜叶片，在液氮中研磨成粉末状(越细越好)。将粉末

移到50 ml离心管中。

2. 加入16 mL细胞提取液，充分混匀，65℃水浴保温20min。

3. 从水浴锅中取出离心管，加入5 mL 5 mol/L的KCl溶液，混匀水浴

20min。

4. 4000rpm/min离心20 min。（以上每小组做一管，以下步骤中每人

做一小管）

5. 将上清液转移到1.5 mL的离心管中。6. 加入等体积酚/氯仿混匀，12000 r/min离心5 min，取上清。

7. 加入等体积氯仿混匀，12000 r/min离心5 min，取上清。

8. 加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。

9. 离心，去上清，获得沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀3次，风干沉淀。

10. 加入500 uL TE缓冲液，溶解DNA。

11. 取3 uL 上清液，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

五、实验报告

绘出琼脂糖凝胶电泳检测DNA图

六、思考题

1. SDS、液氮、异丙醇、氯仿等分别有什么作用？

实验五 植物RNA的提取及电泳

一、实验目的

1. 学习植物总RNA的提取方法和RNA的琼脂糖凝胶检测。

2. 掌握RNA提取原理、方法和RNA质量检测技术。

二、实验原理

用液氮研磨植物组织，高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质、

破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶。细胞裂解后，

DNA、蛋白质和细胞碎片等可通过酚、氯仿等去除，得到总RNA。

三、实验仪器与材料

1. 材料： DEPC，NaAc,LiCl,MOPS,EDTA,异硫氰酸胍，氯仿，酚，

乙醇，琼脂糖，50ml离心管，研钵、研杵，吸头，液氮，一次性手套，

棉手套，甲醛等。

2. 溶液或试剂：4mol/L异硫氰酸胍；2mol/L NaAc（pH4.8）；

4mol/L LiCl；3mol/L NaAc（pH5.0）；以上溶液用DEPC处理过的水配

制。0.1% DEPC水；5×电泳缓冲液；变性琼脂糖凝等。

3. 其他用具：低温离心机，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，凝

胶成像系统，制冰机，水浴锅，灭菌锅等。

四、操作步骤

1. 取2g新鲜菠菜叶片，在液氮中研磨成粉末状，将粉末移到50 ml

离心管中。

2. 依次加入以下溶液，混匀： 异硫氰酸胍溶液 4 mL 苯酚 3mL

NaAc（pH4.8） 0.3mL 氯仿 0.6 mL

3. 冰浴30min后，8000rpm离心13 min。（以上每小组做一管，以下

步骤中每人做一小管）

4. 弃沉淀，将上清液400 uL转移到1.5 mL的离心管中。