研究生课程考核试卷（适用于课程论文、提交报告）科目：细胞生物学实验及研究方法教师：宋关斌姓名：学号：专业：生物学类别：学硕上课时间：年月至年月考生成绩：卷面成绩平时成绩课程综合成绩阅卷评语：阅卷教师(签名)重庆大学研究生院制重庆大学生物工程学院2014级硕士生《细胞生物学实验及研究方法》课程考核1.试结合你感兴趣的领域，以某种细胞为研究对象，依据本学院的实验条件设计一个1年期的小课题。
请简述立题依据和拟选取的研究内容和研究方法。
（20分）答：目前癌症的发病率越来越高，其中肺癌的发病率更是居高不下，因而以人肺癌细胞A549为研究对象。
立题依据：核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种作用十分广泛的真核细胞转录因子。
近年来的研究显示核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）的活化能够调节肿瘤细胞的侵袭和转移。
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）由肿瘤细胞分泌，能够分解细胞外基质中的Ⅳ型胶原。
肿瘤细胞在侵袭的过程中必须穿过富含Ⅳ型胶原的细胞外基质，才能扩散到身体其他部位，因此MMPs 在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥重要的作用。
但是对于NF-κB 活性的改变对肺癌细胞株A549 细胞侵袭能力是否也有影响，目前尚无相关研究报道。
研究内容：用表达IκBα的真核表达质粒pcDNA3.1（+）/IκBα转染体外培养的A549 细胞，以抑制A549 细胞的NF-κB 活性，观察NF-κB活性降低A549 细胞侵袭能力以及对MMPs 表达的影响。
研究方法：①构建表达NF-κB 抑制物α同分异构体（inhibitor of NF-κB，αisoform，IκBα）的真核表达重组质粒pcDNA3.1（+）/IκB α。
②体外培养A549 细胞，分为未转染组（不转染质粒）、转染pcDNA3.1（+）组、转染pcDNA3.1（+）/IκBα组，分别转染相应的质粒。
③应用RT-PCR、Western blot检测各组细胞IκBα的表达情况，应用凝胶电泳迁移率改变实验（electrophoreticmobility shift assay，EMSA）检测各组细胞NF-κ B 的活性，应用Transwell 侵袭小室检测各组细胞的侵袭能力，应用RT-PCR 方法检测各组细胞MMP-2、MMP-9 的mRNA 水平，应用明胶酶谱法检测各组细胞基质金属蛋白酶-2 （matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的活性。
2.你认为近几年在细胞生物学研究领域有哪些值得关注的新技术？简述其原理和应用价值？（20分）答：①在蛋白质的检测方面，2012年年底《Nature Method》中提到了一种基于质谱的定向蛋白质组学技术-SATH（Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions,SWATH）技术。
原理：SWATH技术根据待分析的目标蛋白氨基酸序列，选择对应的蛋白质特异性肽段及蛋白质特异性肽段对应的高响应子离子，最后用高响应子离子的信号强度来反映该蛋白质的表达丰度。
此方法将原来用的普通三重四级杆质谱仪进行改造，用一个高分辨率的TOF质量分析器代替第三个低分辨率的三重四级杆（即四级杆飞行时间杂交质谱仪），并连续运行32个25Da 宽的离子分离窗口，对每个窗口内的离子进行全碎裂。
利用碎片离子谱图库来挖掘，碎裂多肽二级谱中特定多肽的特征碎片离子，进而实现了对多肽的同时鉴定和定量。
应用价值：SWATH技术是一种不依赖数据采集的质谱分析技术，质谱仪在不需要考虑信号强度的情况下也可以对复杂的肽段离子进行分选，然后再与数据库中已有的肽段数据进行比对就可以得出特定肽段的信息。
因此，此技术可以摆脱免疫方法对抗体的依赖，同时连续运行32个25Da 宽的离子分离窗口使得其具有高通量和高灵敏度。
②RNA干扰技术。
原理：简单的说是利用一些小的双链RNA（DsRNA）来高效特异性阻断体内特异基因的表达，并促使mRNA降解，从而诱使细胞表现出特定基因表型的缺失。
首先dsRNA 经过一种核酸酶III类似的RNA 内切酶Dicer 作用, 把dsRNA 链酶切成长约21到25nt 的dsRNA 链，即siRNA, siRNA 和另一些尚未完全确认的蛋白结合形成复合物-RNA 诱导沉默复合物( RNA- inducing silence complex, RISC) 。
RISC再识别, 结合与siRNA 中的反义链互补的mRNA。
RISC 具有核酸酶的功能, 在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂mRNA 随即降解, 从而使该基因的表达受抑。
应用价值：依据RNA 干扰现象, 科学家建立了RNA 干扰技术, 即人为设计合成针对某特定基因序列的dsRNA来关闭或抑制该基因的表达。
它可有效地将靶基因的表达水平降到一个低的水平, 甚至于完全的清除。
RNA 干扰技术开辟了基因治疗的新思路。
③基因定点修饰技术中CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术。
原理：它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成。
首先，CRISPR 的高度可变的间隔区的获得，指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间(repeats)而获得CRISPR 的高度可变的间隔区(spacer)。
其次是CRIPSR 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)，再次是CRISPR/Cas 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰，最终实现基因组的精确修饰。
应用价值：CRISPR 系统能够区分自身DNA 和外源DNA 避免发生自身免疫。
CRISPR/Cas9 突变型的切口酶来介导同源重组修复突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS 细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内．这种方法既能提高同源重组效率，又能避免使用ZNF、TALEN 和CRISPR/Cas9 时的脱靶效应造成的潜在危险。
④诱导多能干细胞技术。
原理：通过外源导入与多能性相关的转录因子来激活体细胞中多能性基因，诱导体细胞核发生重编程, 从分化状态转变成多能性干细胞。
应用价值：iPS 细胞为研究临床疾病的发病机制、发现新药物和新治疗方法以及开展个性化治疗方面提供了重要的技术支撑。
制备疾病特异性干细胞长期以来都是再生医学领域的目标，而iPS 细胞的出现使得该目标变成了一项常规操作。
将各种患者来源的细胞（神经系统的帕金森病、血液系统的可尼贫血与镰刀细胞型贫血、代谢系统的I型糖尿病）诱导成IPS细胞，这些细胞模型为深入研究疾病的发病机制、体外药物筛选、治疗效果评价方面提供了一个非常有用的技术平台。
在细胞替代治疗方面，iPS 细胞由于不存在异体移植免疫排斥以及后续必须应用抗排斥反应药物的问题，具有广阔的临床应用前景。
3. 某实验室合成了一种水溶性的抗肿瘤药物A，欲在细胞水平上检测其药效，拟以人肝癌细胞HepG2为研究对象评价A药物的抗肿瘤效果。
请设计相关实验方案并简要说明其原理。
（20分）答：要了解此种抗肿瘤药物A对人肝癌细胞的抗肿瘤效果，即是通过细胞给药后观察肿瘤细胞的增值和凋亡状况，从而判断A药物的抗肿瘤效果。
药品处理与细胞的培养因为A药物是水溶性的，所以用生理盐水充分将A药物溶解，微孔滤膜(0. 22μm)除菌，使用时以培养液稀释至所需浓度。
人肝癌细胞HepG2用含10% 小牛血清的RPMI1640 完全培养基，在37℃、5% CO 2 的培养箱中培养。
种板前取对数生长期的细胞用0. 05% 胰蛋白酶消化后离心，用4g/L 台盼蓝染色后计算细胞数和活率( > 98% )，并将细胞密度调整为 1. 5 ×10 5 /ml备用。
体外抗肿瘤活性测定四氮唑蓝比色法(MTT 法)----其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
通过比较各加了药物的孔里细胞的数量来判断药物A对人肝癌细胞HepG2的抑制作用，进而判断其抗肿瘤效果。
取对数生长期的HepG2肝癌细胞以每毫升 1. 5 ×10 5 个接种于96 孔培养板中，每孔200μl，每组重复 3 孔。
实验组加入不同剂量的药物A , 对照组加入等体积含0. 01% 丙二醇的RPMI- 1640 溶液(贴壁细胞预培养24h 贴壁后加药)。
药物作用48h 后加入MTT(5mg/ml)，继续培养4h 后，小心吸弃上清液，加入DMSO 150μl 振荡溶解完全后酶标仪检测(570nm)，根据下列公式计算抑制率。
并通过显微镜观察细胞形态。
抑制率(%) =(1 －实验OD 值/对照OD 值) ×100%流式细胞仪检测凋亡率取对数生长期的HepG2肝癌细胞以 1. 5 ×10 5 /ml 接种于 6 孔板，实验组加入不同剂量的药物A，对照组加入等体积含0. 01% 丙二醇的RPMI- 1640 溶液。
作用48h 后收集各组细胞按下列步骤处理细胞。
①冷PBS 洗涤细胞 2 次(2000rpm 离心5min);收集 1. 5 ×10 5 /ml。
②加入500μl 的BindingBuffer 悬浮细胞。
③加入5μlAnnexin V-FITC 混匀后，加入5μl PI，混匀。
④室温，避光、反应15min。
⑤在1h 内进行流式细胞仪检测。
