病毒性肝炎基因诊断芯片的临床检测

３　ＶｉＨｅｒｓ　Ｄ，Ｅｓｐａｚｅ　Ｅ．（　ｅ＿Ｂｕ　Ｍ，ｄ　ａｌ　Ｎｏｓｏｃｏｎａａ【　Ａｃｉ　Ｊｌｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂｄｕｍａｎｎｉｉ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｒｓｓ：ｍｌｃｍｂｉｏｌｏｇｉｅａ［ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　Ａｎｎ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ，１９９８，１２９：１８２—１８９．　４　Ｔｉｌ｜ｅｙ　Ｐ，Ｒ（　呲ｓ列ＢａｃｔｅｒｅｒＮａ　ｔｈ　Ａｃｌｎｅｔｏｂａ￣ｅｒ　ｐ嘲髓：　ｒｉｓｋ［ａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｍ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｅｔｔｉｎｇｓ　Ｃｌａｎ　Ｉｎ—　ｆｅｅｔ　Ｄｉｓ，１９９４．１８：８９６　９ＯＯ　

病毒性肝炎基因诊断芯片的临床检测　赵伟刘伟刘新钰周镇先张林　肝炎基因诊断芯片是将肝炎病原体的特征性基因片段　或基因组成设计的探针序列，以微矩阵型密集排列在经过特　殊址理的玻片上Ｉ　ｔｌ　把待测血液、分泌物等标本中抽提出的　微量肝炎病原体的ＤＮＡ或ＲＮＡ荧光标记后与探针杂交．用　特有的荧光波长扫描芯片，得到肝炎病原体基因的图片，再　经计算机软件分析出建些肝炎病原体基因在标本内的分布　情况。我们用基因诊断芯片对４Ｏ倒乙型肝炎患者、ｚｆｌ例丙　型肝炎患者及３Ｏ例正常人血清进行了双盲检测，现将结果　报告如下。　材料和方法　一、芯片制备　芯片由上海博华公司｝６Ｉ备．玻片购自Ｓ￣ｇｒｎａ公司，醛基修　饰雎。芯片所用乙型肝炎ＤＮＡ靶基因和丙型肝炎ｃＤＮＡ基　因及对照植物基因均由上海博华公司提供，以通用引物进行　ＰＣＲ扩增，引物长度为３０　ｂｐ，ＰＣＲ反应体系为８０　，其中单　脱氧桉苷酶（ｄＮＴＰ）终浓度为５００凹　／Ｌ，用１％琼脂糖凝胶　电泳观察ＰＣＲ产物的质量与浓度，反应完成后　通过Ｇ－５０纯　化柱除去末端掺人的荧光标记单核苷酸。ＰＣＲ产物用异丙　醇沉淀后，溶于点样液中，并使ＤＮＡ浓度为５００　１，用　ｃａｒｔｅｓｍ　７５００点样仪进行点样，将点样后的玻片进行扫描，　然后经过水台、干燥、置于紫外交联仪中交联（能量值设定　６５　ｍｌ／ｃｍ），再用０．２％十二烷基硫酸钠（ｓＤｓ）在室温下洗　涤５　ｒａｉｎ，最后用ｄｄ　。涮洗２次，每次ｌ　ｒａｉｎ．晾干备用。　二、血清标本　血清标本均来自本院住院患者、其中急性己型肝炎１０　倒，慢性乙型肝炎３０例，急性丙型肝炎５倒，慢性丙型肝炎　１５倒，３Ｏ倒阴性对照血清来自体检健康人群。己型肝炎血　清用美国雅培设备和雅培试剂，进行ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡＥ、抗　基金项目：江苏省科学拄术委员会科研项目（ＢＳ２０００１／２８）；江苏　省２０００年　３３３工程“项目（２００∞１　作者单位＝２１０００３南京．东南大学医学院附属南京市第二医院　４月第２０　Ｖ０Ｊ　２０　５　Ｄｏｎａｌｄ　ＨＭ，Ｓ￣ｉｆｅ　Ｗ　：￣ｎｙｅｓ　ＳＧ，ｅｌ＂ａ【Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙ　５　ｏｆ　ＡＲＩ一１，ａ　ｎｏｖｅｌ　ＯＸＡ　Ｉａｃｔａ】ｎａｓｅ，ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｉｍｉｐｅｎｅｎｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ａｃｉｎｅｍｂａｃｔｅｒ　ｂａＩＪｒ眦ｎｒｕ】６Ｂ９２　Ａｎｔｉｒｎｉｃｍｂ　Ａ一　釉硌０　耐　．２Ｏ∞，４４：１９６　１９９　（收稿日期：２００】　０８】７）　（本文编辑沈漱瑜）　ＨＢｓ、抗ＨＢｃ、抗一ＨＢｅ荧光微粒子定量测定　丙型肝炎　ＨＣＶＲＮＡ测定用ＰＣＲ方法，试剂来自华美生物工程公司。　乙型肝炎和丙型肝炎血清经检测均无重叠感染。　三、待测血清样品处理　取５Ｏ　【被检血清，加＾试剂Ａ１５０　ｌ混匀，加人试剂Ｂ　１００　ｌ混匀，１４　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心５　ｔｔｌｉｎ，取上清液［００　ｕ【加　１００　【试剂ｃ混匀，１　４　０００　ｒ／ｒａｉｎ，离心１Ｏ　ｒａｉｎ．弃上清液，加　＾３００～４００　ｌ的７５％预冷酒精，１４　０００　ｒ／ｍｉｎ．离心５　ｍｉｎ，　＿彝上清液，快速抽干备用　四、反转录及ＰＣＲ扩增　每份样品中加入ＰＴ－ＭｉｘＩ　６．８　１，７Ｏ。Ｃ水浴５　ｍｉｎ、再　加入ＲＴ．ＭｉｘＩ１　０　２　ｌ，４２。Ｃ水浴３Ｏ　ｍｉｎ进行反转录　取　ＰＣＲ　Ｍｉｘ　Ｉ　４ＯⅡ【．Ｔａｑ　ＤＮＡ聚台酶０．４　【，加入反转录产物　进行第１次ＰＣＲ扩增，然后取ＰＣＲＭｉｘＩＩ　２３“－由口Ｔｅ，ｑＤＮＡ　聚台酶０　２　１，加入ＣＹ５一ｄＵＴＰ　０　５　１，混匀后取２３　２　１分　别加人每个Ｏ　２ｍｌ的离心管中再取第１敬循环产物２　，离　心数秒后．进行第２次ＰＣＲ扩增　五、杂交　在各管中分别加入２　的ｔＲＮＡ和１　的鱼精ＤＮＡ，　９４。Ｃ快速抽干备用，加入预热的杂交试剂Ａ　５　１，溶解探针　及杂交试剂Ｂ　５　ｌ，馄匀后５　０００　ｒ／ｍｉｎ离心数秒，将探针及　芯片置于９５。Ｃ水潜锅内变性２　ｍｉｎ，其中玻片插＾染色缸　中变性，将变性好的探针避光球褡，将变性好的芯片插到盛　有无求乙醇的染色缸内室温放置３０　ｓ．取出，置９５℃水浴锅　外罩上烤干．将娈性好的探　，滴于玻片上的点样区，置于　罗宾１０００型杂交炉内，４２。Ｃ杂交２　５　ｈ，用０　Ｉ％标准枸椽　酸盐水溶液冲掉盖玻片，避光晾干后扫描。　六．检测分析　用ＳｅａｎＡｒｒａｙ　３０００扫描仪扫描芯片．得到ＣＹ５图像文　件，通过圈点确定杂交范围，过滤背景噪声，提取基因表达　的荧光信号强度值，用预先定的内参照基因（植物基因）对　ＣＹ５的原始提取信号进行均衡和用ＩｍａＧｅｎｅ３　０软件分析　ＣＹ５荧光信号的强度和比值，根据以下条件判定基因阳性　表达的标准。１．ＣＹ５阳性点的荧光信号平均值超过阴性点　

维普资讯 http://www.cqvip.com ４月第２０卷第２期Ｃｈｉｎ　Ｊ】ｎｆ　ｔＤ　Ａ　信号的３倍，比值范围＞２　７；２　阴性荧光信号值＜８００　ＣＹ５阳性荧光信号值碱击阴性荧光信号值后＞４００；３　ＰＣＲ　结果良好。　结　果　一、乙型肝炎病毒标志物费光微粒子法定量　４０例乙型肝炎患者病毒标志物阳性．ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ　抗一ＨＢｓ、抗ＨＢｃ、抗ＨＢｅ定量值分别在１　５１～１　８１２　４　Ｓ／　Ｃｏ，２９７～８　９７０保罗埃利希（ＰＥＩＵ）／ｍｌ，０　０１～０　２５　Ｓ／Ｃｏ，　０．０～８　７　Ｓ／Ｃｏ，０．３２～２１７　Ｓ／Ｃｏ之间　二、丙型肝炎血清检测　抗一Ｈｃｖ阳性２０份，ＰＣＲ检测Ｈｃｖ　ＲＮＡ阳性１２份。　三、基因芯片检测　乙型肝炎基因芯片检测阳性３０例（１０例为急性乙型肝　炎，其余为慢性乙型肝炎）．芯片阳性点ＣＹ５荧光信号值在　１８　２】８～５３　０３０之间．阳性参＿附值在２　４６７～８６　３２３之间，比　值在３　１０～１３　１７之间；阴性ｌ０例，芯片ＣＹ５荧光信号值　在８．２３～３８９之间，阴性参照值在４　２６１～４５　４７９之间，比　值均＜ｌ。　丙型肝炎基因芯片检测阳性８例（其中ＨＣＶ　ＲＮＡ阳　性６倒；ＨＣＶ　ＲＮＡ阴性、抗ＨＣＶ阳性２侧。５倒为急性丙　型肝炎）。阳性点ＣＹ５荧光信号值在】ｌ１０～１　６１ｌ之间，阳　性参照值在１　４９８－－３７　０３３之间．比值均＞２　７；阴性　ＣＹ５　荧光信号值在８　１～５６１之问比值＜１　３０例健康』、血清　乙、丙型肝炎基因芯片检测结果均为Ｉ５ｆＩ性。　讨　论　目前基因芯片的制作方法主要有６种，原位光刘合成，　原位喷印合成，点样法．电子　片．三维芯片和流过式芯片．　各有特点¨　。原位光刻合成由美国Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司开发．　是在合成碱基单位体５　羟基末端连一个光敏保护基，利用　光照射使羟基端脱保护，然后把一个３　端保护的核昔酸单　体连接上去，这个过程反复进行合成出高密度的阵列　原　位喷印合成采用的化学原理与传统的ＤＮＡ固相合成一致，　通过特定的喷印头将４种碱基喷印在芯片上特定位置＝电　子芯片是在电场作用下，生物素标记的探针可结合在特定　电极上形成快速杂交，但制备复杂，成本高　三维芯片是蒋　ｌ万多个微小聚乙烯酰胺凝胶条固定在微镜载玻片上．用于　靶ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质的分析。目前我们所用的芯片是采　用点样法制作的低密度芯片．即将台成好的探针（ｅＤＮＡ或　ＲＮＡ）直接用点样仪点在芯片的特定位置上，其特点是定量　准确，重现性好．制作芯片的成本低，操作简单，并且可　根　据实际需要设计芯片探针数量１　５　ｔ２　Ｊ。　传统的肝炎病毒标志物检测方法ＥＬＩＳＡ相比，基因　芯片检测的对象是ＤＮＡ或ＲＮＡ．只要』、件内有病原颗粒　就能检出，而ＥＬＩ￣．方法检测的是抗原和抗体，由于人体对　外来病毒产生免疫有一定时滞，所以ＥＬＩＳＡ对无免疫应答　者和预前患者的检测存在困难，而基因芯片对预前、预中、　预后的检测均适合。基因芯片信号结果是用荧光丰＿描仪扫　描获得．其扫描仪的分辨率可达１０　ｍｍ．远比传统的酶标检　测仪高。本欢所用芯片共有乙型肝炎和丙型肝炎阳性对照　探针组，乙型肝炎检测揉针组．阴性对照组．设计在同一张　芯片上．可同时检测２种类型的肝炎病毒　基困芯片进行　的杂交，也不同于耳前的ＰＣＲ基因检测方法．其阴性．阳性　对照和待捡样品的ＤＮＡ特异性杂交，都是在同一反应体中　进行，可　很好的对同一反应体系中的阴性、阳性结果进行　监控分析．保证ＩｌＩ｛性对照检出假阴性，阳性对照检出假阳　性，而传统的Ｉ）（｜Ｋ检测方法阴、阳对照是在不同的反应管　中进行的．即使是ＥＬＩＳＡ方法中其阴性和阳性对照分别在　样板槽的左卜角或下角．虽然对照和样品中平行实验．但是　在不同的的反应管中（反应体系）平行进行，不能Ｈ根本上　消除假阴、阳性。本组３０例健康』、血清同乙型肝炎　雨型　肝炎血清一起双盲测定，无１例假阳性出现　４Ｏ例乙型肝炎阳性血清基因芯片测定．３０例阳性病例　均为ＨＢｅＡｇ明显升高．荧光微粒于法定量值在（】３３１　８７５　

～８　９７０　８５）之间，病毒复制指标明显，血清病毒含量较高．　而ＨＢｅＡｇ荧光微粒于法定量值在（４６７　８５～２００）之间的５　恻低滴度ＨｇＶ感染和ＨＢｅ缸阴性、Ｈ＆抽　性和抗Ｈｇｃ　阳性的５例血清，基因芯片删定均为阴性．说明基田芯片检　测的灵敏度尚ｌ币高．可能与芯片技术的开发时间较短　技术　尚　成熟有关。虽然基因芯片诊断技术较ＥＬＩＳＡ方法有很　多优点，但目前并　能完全替代乙型肝炎病毒的抗原抗体　检测，尤其是ＨＢｅＡｇ血清清度较低或ＨＢｅＡｇ阴性的患者，　基因芯片不能检出。ＨＰ，ｓＡｇ阳性仍是乙型肝炎病毒谚断的　重要标志　本欢丙型肝炎基　芯片双盲检测常规ＰＣＲ　ＨＣＶ　ＲＮＡ　阳性１２例中，基因芯片检出阳性６例，而ＨＣＶ　ＲＮＡ阴性、　抗ＨＣＶ阳性８例中基因芯片检　阳性２例，总的阳性检出　率为８／２０．说明芯片在血清中检测ＨＣＶ　ＲＮＡ技术尚　成　熟，主要原因可能有，丙型肝炎患者血清中ＲＮＡ含量本身　较低，且血清中容易降解．ＰＣＲ扩增效果不好，逆转录酶失　活对逆转录产物的负面影响和雨型肝炎病毒本身变异系数　大，模板的保守性不高，检测荧光信号差有关，这方面的技　术有待进一步探索。