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不同溶剂和受试物颜色对MTT实验的影响

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广　西　医　科　大　学　学　报　２００７　Ｆｅｂ；２４（１）　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＧＵＡＮＧＸＩ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　

不同溶剂和受试物颜色对ＭＴＴ实验的影响　陈艳华　黎丹戎△　侯华新　邱莉　张　玮　（广西肿瘤防治研究所南宁　５３００２１）　

摘要　目的：探讨ＭＴＴ实验中不同溶剂对细胞的生长抑制作用和受试物颜色对实验结果的影响。方法：用ＭＴＴ比色方法比　较不同溶剂（乙醇、脂肪乳、二甲基亚砜、乙酸乙酯、氯仿、吐温８０）对卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞的生长抑制作用及受试物（黄芩素、茶　多酚、阿霉素）颜色对ＭＴＴ显色反应的影响。结果：１Ｏ　以上浓度的乙醇、乙酸乙酯、５　二甲基亚砜、２Ｏ　以上浓度的氯仿和　所有浓度的吐温８ｏ对卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞的生长均有不同程度的抑制作用，且随浓度的递增抑制作用进一步加强，而脂肪乳　细胞毒性甚微，浓度高达５Ｏ　仍不会对细胞产生明显的抑制作用。吐温８Ｏ不宜作为ＭＴＴ实验受试物的溶剂。药物黄芩素、　茶多酚和阿霉素本身的颜色会增加ＭＴＴ实验中的吸光值，导致结果出现假阴性。结论：不同浓度的溶剂和受试药物的颜色　会干扰ＭＴＴ的实验结果，在采用ＭＴＴ法时必须设定溶剂和有颜色受试药物的对照组，否则将不能利用ＭＴＴ的实验结果正　确评价受试物对细胞的生长抑制作用。　关键词　ＭＴＴ法；溶剂；受试物；干扰　中国图书资料分类法分类号　Ｑ２；Ｒ９７９．１　

ＴＨＥ　ＥＦＦＥＣＴ　ｏＮ　ＴＨＥ　ＲＥＳＵＬＴＳ　ｏＦ　ＭＴＴ　ＡＳＳＡＹ　ＢＹ　ＤＩＦＦＥＲＥＮＴ　ｏＲＧＡＮＩＣ　ＳｏＬＶＥＮＴＳ　ＡＮＤ　ＴＨＥ　ＣｏＬｏＲ　ｏＦ　ＤＲＵＧＳ　ＴＥＳＴＥＤ　Ｃｈｅｎ　Ｙａｎｈｕａ，Ｌｉ　Ｄａｎｒｏｎｇ，Ｈｏｕ　Ｈ　ｕａｘｉｎ，ｅｔ　ａ１．（Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｎａｎｎｉｎｇ，５　３００２　１　Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｏｆ　ｄｒｕｇｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｃａｎ　ｉｎ—　ｔｅｒｆｅｒｅ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ（ｅｔｈａｎｏｌ，ｅｔｈｙｌ　ａｃｅ—　ｔａｔｅ，ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ｔｗｅｅｎ　８０　ａｎｄ　ｆａｔ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｉｎｉｅｃｔｉｏｎ）ｆｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ＳＫＯＶ３　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｏｆ　ｄｒｕｇｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅ—　ｓｕｉｔｓ　ｏｆ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｏｖｅｒ　１０　ｅｔｈａｎｏｌ　ａｎｄ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ，５　ＤＭＳＯ，２０　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ａｎｄ　ａｎｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｅｅｎ　８０　ｈａｖｅ　ｖｅｒｙ　ｓｔｒｏｎｇ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｆｏｒ　ＳＫＯＶ３　ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＳＫＯＶ３　ｇｒｏｗｔｈ　ｗａｓ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｆａｔ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ．Ｗｈｅｎ　ｉｔｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｇｅｔｔｉｎｇ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　５０　，ｉｔ　ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｓｅｅｍ　ｔｏ　ｃａｕｓｅ　ａｎｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｈａｎｇｅ．Ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｗｅｅｎ　８０　ｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｓｅｒｉｏｕｓ　ａｎｄ　ｉｔ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｆｉｔ　ｆｏｒ　ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ　ａｇｅｎｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｏｆ　ｄｒｕｇｓ　ｔｅｓｔｅｄ（ｐｏｌｙｔｅａｐｈｅｎｏｌ，ｓｃｕｔｅｌｌａｒｅｉｎ，ＡＤＭ）ｃａｕｓｅｄ　ａ　ｒｅｌ—　ａｔｉｖｅｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ｖａｌｕｅｓ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｇｉｖｉｎｇ　ｒｉｓｅ　ｔｏ　ｆａｌｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ（ｕｎ—　ｔｒｕｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ　ｔｈａｔ　ｂｅｆｏｒｅ　ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ，ｄｒｕｇｓ　ｏｒ　ａｎｙ　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｔｏ　ｂｅ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｓｓａｙ．ｔｈｅ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎ—　ｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｒｕｇｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　ｔｅｒｍｓ　ｏｆ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｆｉｒｓｔ，ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ　ｉｔ　ｍａｙ　ｂｅ　ｉｍｐｏｓｓｉ—　ｂｌｅ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ＭＴＴ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ａｓｓａｙ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ＭＴＴ　ａｓｓａｙ；ｓｏｌｖｅｎｔｓ；ｄｒｕｇｓ　ｔｅｓｔｅｄ；Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　

四甲基偶氮唑盐比色法（ＭＴＴ法）由ＭｏｓｒｎａｎｒｎⅢ在　＊本课题获广西科学研究与技术开发项目资助（Ｎｏ桂科攻０２３５０２４　２４）　△通讯作者　１广西医科大学化学教研室　收稿日期：２００５—１０—１０　

１９８３年首创，其原理是活细胞内的线粒体琥珀酸脱氢酶可将　ＭＴＴ还原成蓝紫色甲瓒，而且形成的量与活细胞数量成正　比关系。该法已被广泛应用于细胞系的体外抗癌药物筛选　及肿瘤临床的化疗药敏测定［２　］。在抗肿瘤药物的体外筛选　中，常常碰到许多水溶性较差的待筛选样品，需借助有机溶　剂才能溶解，而大多数有机溶剂存在较强的非特异性细胞毒　性ｌ４］，造成假阳性结果，同时由于ＭＴＴ是比色测定，故受试　

维普资讯 http://www.cqvip.com ・　１８　・　广西医科大学学报２００７　Ｆｅｂ；２４（１）　药物本身的颜色也会干扰结果的准确性。为此笔者进行了　不同的有机溶剂对卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞的生长抑制作用及不　同颜色药物对ＭＴＴ法结果影响的实验研究，以期发现毒性　低、溶解性能较好的溶媒体系以及排除受试物颜色对ＭＴＴ　实验结果干扰的方法，这对抗肿瘤药物体外筛选实验具有一　定的参考价值。　ｌ材料与方法　１．１　材料　１．１．１　肿瘤细胞系：卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞株由广西肿瘤防治　研究所临床实验中心传代保存。　１．１．２试剂及药物：ＭＴＴ（噻唑蓝）为Ｓｉｇｍａ公司产品，ＲＰ—　ＭＩ１６４０为Ｇｉｂｃｏ公司产品，乙醇、乙酸乙脂、氯仿、吐温８Ｏ、　脂肪乳、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为国产分析纯试剂，黄芩素为本　课题成员从黄芩中提取获得，结构与理化特性与文献报道一　致　，茶多酚ＧＴＰ（含量为９８．２　）由广西桂林实力天然食　品有限公司提供，盐酸阿霉素（ＡＤＭ）为浙江海正药业股份有　限公司生产。　１．１．３实验仪器：荧光倒置显微镜为德国Ｌｅｉｃａ公司生产，　酶联免疫检测仪为芬兰Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ　Ｄｒａｇｏｎ　ｗｅｌｌｓｃａｎ　ＭＫ３型。　１．２方法　１．２．１不同溶剂对卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞的生长抑制作用：取　细胞浓度为１×１０　ｃｅｌｌ／ｍｌ的卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞１００　１加　入９６孑Ｌ板中，３７　Ｃ培养２４　ｈ后，加入１００　１不同浓度的溶　剂（乙醇、乙酸乙脂、氯仿、吐温８Ｏ、脂肪乳、ＤＭＳＯ）到９６孑Ｌ　板中，空白孑Ｌ加１００　１细胞培养液，３７℃培养２４　ｈ，每孑Ｌ加　２Ｏ“１　ＭＴＴ，３７℃继续孵育４　ｈ，小心吸弃孑Ｌ板中的所有试　剂，加入２００　１　ＤＭＳＯ，１０　ｍｉｎ后用４９０　ｎｍ波长，在酶联免　疫检测仪上测定各孑Ｌ的吸光值（ＯＤ值），记录结果并计算抑　制率（ＩＲ）一（对照组ＯＤ值一实验组ＯＤ值）／对照组ＯＤ值　×１００　。　１．２．２　不同颜色物质对ＭＴＴ实验的影响：取细胞浓度为　１×１０。ｃｅｌｌ／ｍｌ的卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞１００”１加入９６孑Ｌ板中，　３７℃培养２４　ｈ后，细胞分为Ａ、Ｂ两组，其中Ａ组加入１００　１　不同浓度具有颜色的药物（黄芩素、茶多酚、ＡＤＭ），Ｂ组仅加　入等量细胞培养液，３７℃培养２４　ｈ后，Ａ组每孑Ｌ加２Ｏ　１　ＭＴＴ，３７℃继续孵育４　ｈ，小心吸弃孑Ｌ板中的所有试剂，加入　２００“ｌ　ＤＭＳＯ。在未加入ＭＴＴ的Ｂ组细胞的孑Ｌ板中分别加　入１００　１不同浓度具有颜色的药物和１００　１　ＤＭＳＯ，１０　ｍｉｎ　后用４９０　ｎｍ波长，在酶联免疫检测仪上测定各孑Ｌ的吸光值，　记录结果并计算相应浓度的抑制率及扣除药物本身颜色干　扰后的抑制率。　１．２．３统计学处理：采用ＳＰＳＳ１０．０统计软件行ｔ检验，Ｐ　ｄ０．０５为差异有统计学意义。　

２　结　果　２．１　不同溶剂对卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞的生长抑制作用：在浓　度为１Ｏ　时乙醇和乙酸乙酯的抑制率分别为５４．８２　和　６Ｏ．５５　；浓度为５Ｏ　时分别高达９３．８ｌ　和８８。４５　；ＤＭＳＯ　浓度在５　时即具细胞毒性，其抑制率为５Ｏ．４６　，氯仿浓度　为２Ｏ　时抑制率为４８．１　７　。以上５种溶剂对卵巢癌ＳＫ—　ＯＶ３细胞的生长抑制率均随着浓度的增加而增强。同时实　验结果表明不论吐温８Ｏ的浓度如何，ＯＤ值均较低，可能为　吐温８Ｏ影响ＭＴＴ显色的缘故所致。而脂肪乳对细胞毒性　影响不大，浓度高达５Ｏ　仍不产生明显的抑制作用，结果见　表１。　

表１　不同溶剂对ＭＴＴ结果的影响（”一３，　±ｓ）　

注：　溶剂浓度为体积分数　２．２　受试药物的颜色对ＭＴＴ结果的影响：由于受试药物　本身所具有的颜色，药物会吸附于细胞表面或附着于孑Ｌ板内　

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MTT细胞增殖实验

MTT细胞增殖实验

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以经溶剂溶解后用酶标仪在570nm 处进行测定。

在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值间接反映活细胞的数目。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

MTT法的实验操作步骤看似简单，但在学习的过程中才发现，要想得到可信而漂亮的检测结果并不是那么容易。

在不断的摸索和老师的指导下，终于得到了满意的结果。

在这里，我对该实验具体操作中遇到的问题进行了归纳总结。

影响因素及解决办法：一、影响复孔重复性的因素：MTT法通常是在96孔板中种上细胞，然后分不同的组给药，设置对照组，以检测药物对细胞的增殖影响。

设复孔的目的是对实验结果可信度的一个有效监测办法。

因为复孔间的差异越小，说明操作越精确。

结果的可信度也越高。

那么是哪些因素影响复孔的重复性呢？首先，应该是孔间细胞是否均匀，只有在每孔的细胞数量尽可能一致的情况下才能建立起后续试验的可信基础。

保证细胞种得均匀主要靠熟练的操作，细节上是在种板的过程中，每种5到6个孔需将细胞悬液吹打几次，因为细胞在重力作用下有下沉的趋势。

一般我们是设3 ~6个复孔，竖行排列，这样方便种板和计算。

可能的情况下，多些复孔检测作用会好些。

其次，是“边际效应”，96孔板放在37℃孵箱中孵育细胞的过程中，周边孔内液体容易挥发，测定数据与中心孔有较大出入，所以周边一圈通常不种细胞而只加PBS,另外得注意保持培养箱的湿度条件。

MTT法原理步骤

MTT法原理步骤

MTT法原理步骤细胞的增殖检测（MTT法）MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长)，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 ，定容1L）4、DMSO（二甲基亚砜）5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

MTT法原理、步骤以及注意事项,综合汇总

MTT法原理、步骤以及注意事项,综合汇总

MTT法原理、步骤以及注意事项,综合汇总摘要：MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝.是一种黄颜色的染料.MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处（也有用570nm波长的,我目前用的都是570nm)测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济.缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测.这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害.MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可.在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好.需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数.在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内.MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了.我自己操作一般是每次配制15ml,过滤后4℃避光保存,在两周内用完.MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解.PBS配方：Nacl 8g ＋Kcl 0.2g ＋Na2HPO4 1.44g ＋KH2PO4 0.24g 调pH 7.4,定容1L.普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件,培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）.3：呈色：培养3-5天后,每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.每孔加150ul DMSO,脱色摇床振荡10min,使结晶物充分融解.4：比色：选择490nm（570nm）波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.药物MTT法实验步骤贴壁细胞：（我的主要操作是贴壁细胞）1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000-10000 孔,（边缘孔用无菌PBS填充）.2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞贴壁,加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况.3: 5%CO2,37℃孵育24-72小时,倒置显微镜下观察.4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h.若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液.5: 终止培养,小心吸去孔内培养液.6: 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD490nm （570nm)处测量各孔的吸光值.7: 同时设置调零孔即空白组（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）.悬浮细胞：1: 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释(储存液100mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔）,共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）.每板设对照（加100ml 1640）.2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察.3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4 h.（悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h 后可跳过步骤4）,直接酶标仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min）,小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值.5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）,每组设定3复孔.注意事项：(1) 选择适当得细胞接种浓度.每孔1000-10000个,但是也要看细胞种类和状态.我做的是药物抑制肿瘤细胞生长和增殖,铺过2000至8000个每孔.2000太低,8000过高,对于阴性组高于5000个吸光值就很大,大于1.5.所以对于我自己的A549实验一般选用3000-5000.一般每孔4000个细胞为宜(2) 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验.在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液.(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照.其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零.(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系.（阴性组在0.8-1.2,加药组在0-0.7.）(5) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适根据书上说200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO.加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定(6) MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值.(7) 铺板时要保证每孔铺的细胞数目均匀一致,一般每加几孔就混匀一下.我一般是加完一排复孔就混匀一次.。

利用MTT法检测活细胞数量和结果分析

利用MTT法检测活细胞数量和结果分析




1）对数生长期细胞 2）受试因素（药物或细胞） 3）Actinomycin D 4）MTT：以PBS配制成5mg/ml，抽虑除菌，避光 保存在4˚C 5）DMSO（二甲基亚砜） 6）96孔板 7）酶联免疫检测仪 8）细胞培养箱
三、实验步骤


1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度， 将待测细胞(L-929)调密度至3×105/ml，含 10% FCS的完全培养基，100l/孔，（边缘 孔用无菌水填充），5%CO2，37℃孵育， 至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）。 2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁过 夜。
MTT法
一、原理

噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细 胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使 外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能 被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫 检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可 间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器

6）96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具 有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基 中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种 现象，边缘孔用无菌水填充并要保证培养箱中的湿度，减 少开关培养箱的次数和时间。 7）注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导 致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。 建议使用连续加样器。 8）没有去掉上清直接加DMSO，沉淀会很难溶解。加 DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸 去，也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板，1000r，5 分钟，然后吸掉上清。 9）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种 细胞，而不作为指标检测孔。 10）除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外， 可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱 15分钟溶解结晶。