下载文档原格式
RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。
4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
HIV核酸（RNA）提取（QIAGEN Viral RNA Mini Kit）1.实验前准备●取出样品恢复至室温（15－25℃），解冻待用。
●将AVE缓冲液恢复至室温，以备后续步骤使用。
●取大约1.5ml AVL缓冲液加入一管冻干的Carrier RNA中，待溶解完全后，转入AVL缓冲液瓶中（一管Carrier RNA对应一管AVL31ml），分装到1.5ml eppendorf管中，每管560ul，4℃保存。
AVL／CarrierRNA缓冲液4℃保存时会有沉淀，使用前需37℃预热溶解沉淀。
注：不要将AVL／CarrierRNA缓冲液加热超过6次，每次孵育不要超过5分钟。
●AW1和AW2缓冲液按照说明书上的量加入96－100％的乙醇，乙醇应无RNA酶（无水乙醇）。
●所有离心步骤均在室温进行。
注意：使用无DNase和RNase的Tip头。
2.将560ul准备好的含有CarrierRNA的AVL缓冲液加入1.5ml离心管。
3.将140ul血浆加入盛有AVL／CarrierRNA缓冲液的离心管，振荡混匀15秒。
4.室温（15－25℃）孵育10分钟。
5.将1.5ml离心管短暂离心，消除管盖内的液滴。
6.加入560ul乙醇（96－100％），振荡混匀15秒。
振荡混匀后将离心管短暂离心，消除管盖内的液滴。
7.将630ul步骤6中的溶液小心转入OIAamp RNA提取柱（放置于2ml收集管中），注意不要碰湿柱子边缘。
盖上盖子，6000g(小离心机约8000转)离心1分钟，将柱子移入一新的2ml收集管（提供），丢弃剩有滤液的收集管。
8.小心打开柱子的盖子，重复步骤7。
9.小心打开柱子的盖子，加入500ul AW1液，盖上盖子，6000g(8000rpm)离心1分钟，将柱子放入一新的2ml收集管，丢弃剩有滤液的收集管。
10.小心打开柱子的盖子，加入500ul AW2液，盖上盖子，全速（20000g or 14000rmp）离心3分钟。
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://HighPure Plasmid Maxi Kit高纯度质粒大量快速提取试剂盒目录号：PL12试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存10次(PL1201)RNaseA（10mg/ml）－20℃750µl溶液P1 4℃77 ml溶液P2 室温77 ml溶液N3 室温77 ml去蛋白液PE 室温63 ml第一次使用前按说明加指定量乙醇漂洗液WB 室温25 ml X 2第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温20 ml吸附柱DC 室温10个收集管（50ml）室温10个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入溶液P1后（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。
如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌株如JM系列、HB101也可以轻松去除。
有效防止了质粒被核酸酶降解。
3.不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
快速、方便，从150-300ml大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80 %左右。
M5 Plant RNeasy Complex MiniKit使用说明书产品名称单位货号M5 Plant RNeasy Complex Mini Kit 20T MF045-02M5 Plant RNeasy Complex Mini Kit 50T MF045-05【储存条件】室温储存12个月不影响使用效果。
本试剂盒所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，可在37˚C水浴加热几分钟，恢复澄清后再使用。
【产品简介】在本公司M5 Plant RNeasy mini kit无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又独家研发的基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，离心沉淀去除多糖多酚和次级代谢产物，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA 被选择性洗脱滤过，吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。
滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H2O将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
【产品特色】1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用Whatman特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
2. 不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便，一般可在25-30分钟内完成。
3. 应用性极广，可以提取包括复杂中草药如石斛/丹参/雪莲/人参、复杂淀粉种子如水稻/小麦/玉米种子、复杂果实如葡萄/蓝莓/草莓/西瓜果实、复杂抗逆植物如冬青/松针/沙棘/胡杨、复杂花卉月季/玫瑰/梅/牡丹花、复杂多糖植物紫菜/仙人掌/芦荟水稻种子等数百种样品。
4. 独家研发成功基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。
RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。
4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
一种血液中病原微生物分离富集和核酸提取方法及试剂与流程病原微生物是指引起疾病的微生物，如细菌、病毒、真菌和寄生虫等。
对于一种血液中病原微生物的分离、富集和核酸提取方法，以下是一个示例的试剂与流程，供参考。
试剂：1.纳入病例样本2. 血液分离试剂：如Ficoll-Paque™ PLUS3.细菌液浸液：如生物安B(R)4.组织粉碎液：如细胞裂解缓冲液5.细菌富集试剂盒：如血液细菌富集试剂盒6.病毒富集试剂盒：如病毒核酸提取试剂盒7.寄生虫富集试剂盒：如疟原虫富集试剂盒8.核酸提取试剂盒：如核酸提取试剂盒9. PCR试剂盒：如PCR Master Mix流程：1.收集血液样本，并按照相关的生物安全操作规范进行处理，在带防护设施的实验室进行操作。
2.分离血细胞和血浆：取5-10mL的血液样本，将其加入含有血液分离试剂的离心管中。
将血液和血液分离试剂以体积比例2:1混合均匀，然后离心10分钟，离心速度设置为400g。
离心后，血液应分层形成三个层次，上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。
小心地吸取上层（血浆）转移至新的离心管中，并保存在-70°C的冷冻器中备用。
3.细菌富集与分离-将1mL血液样本加入2mL细菌液浸液中，充分混合后孵育30分钟。
- 将混合液以1 mL为单位分装入2个离心管中，在3500 rpm的离心机上离心10分钟。
-将上清液吸取掉，沉淀用0.5mL生理盐水或PBS洗涤，并进行相应的细菌分离实验。
4.核酸提取-将血浆样本从冷冻器中取出并解冻，按照核酸提取试剂盒说明书的操作步骤进行核酸提取。
-将提取的核酸溶液保存在-20°C的冰箱中备用。
5.PCR扩增-依据需要检测的病原微生物选择合适的引物和PCR试剂盒。
-准备PCR体系，将核酸模板、引物、酶和缓冲液按比例加入PCR反应管中。
-进行PCR扩增反应，设置合适的扩增程序和参数。
-扩增产物可以通过电泳等方法进行分析和检测，以确定是否存在目标病原微生物。
使用说明书Version 20.1目 录 Contents *所有商标均属于各自商标所有者的财产,某些商标并未在全部行政区注册01/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程 08-1/样本处理 08-2/RNA 提取09/常见问题及解决方案................................................................................................... 02................................................................................................... 02................................................................................................... 03................................................................................................... 03................................................................................................... 03 (03) (04) (04) (04) (05) (06)01/ 0201/产品概述本试剂盒适用于植物组织，特别是富含多糖多酚或淀粉的植物组织（如棉花叶片、成熟水稻叶片、松针、杨树、枇杷叶片、马铃薯块茎、棉叶根、香蕉、葡萄、苹果、梨、月季、荞麦种子、拟南芥种子、烟草等）中快速提取总RNA ，可同时处理大量不同样品。
RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。
4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。
试验步骤2再重新作一边。
3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。
4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。
加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。
加入等体积的异丙醇。
室温10min。
2500rpm,离心10min。
弃上清。
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。
-20℃20min。
9、12000r/min,室温离心5min。
弃上清。
将DNA溶于适量TE中。
外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。
4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。
6、3000rpm离心10min，弃上清。
7、倒置离心管，去掉残液。
8、得白细胞，－80?C冻存。
试验要求：血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。
氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：试验试剂：Ligsisbuffer：133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。
ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖 5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。
用于病毒RNA和DNA，并从动物的全血，血清，血浆，其他体液，拭子和洗液，和组织的细菌DNA的纯化
QIAGEN制定标准：
DNA，RNA和蛋白质的纯化
microRNA研究和RNAi
QIAamp cador Pathogen Mini Kit（50）（250）
货号54104 54106
数量50 250
QIAamp迷你色谱柱50 250
收集管（2毫升）200 1000
缓冲区VXL * 6毫升30毫升
缓冲液ACB *†（浓缩液）12毫升60毫升
QIAGEN®蛋白酶K. 1.25毫升 6 毫升
载体RNA（poly A）310μg 310μg
缓冲液AW1 *‡（浓缩液）19毫升98毫升
缓冲液AW2‡（浓缩液）17毫升81毫升
缓冲区AVE§20毫升 2 x 20 毫升
快速启动协议 1 1
储存方式：
室温（15-25℃）干燥储存
注：QIAGEN蛋白酶K可以在室温下储存。
如果长时间存放，或环境温度经常超过25°C，我们建议在2-8°C下存放
程序
1.将20μl蛋白酶K吸移到2ml微量离心管（未提供）中。
2.向蛋白酶K中加入200μl液体样品。
注意：如果处理较低的样品体积，请使用PBS或0.9％NaCl将体积调节至200μl。
3.加入100μlBufferVXL。
关闭盖子并通过脉冲涡旋混合。
为确保充分裂解，将样品与Buffer VXL充分混合，得到均匀溶液。
如果使用含有缓冲液ATL的样品液，例如在酶消化组织后，可能形成沉淀物。
可以通过在56℃下短暂孵育来溶解沉淀物。
但是，它们对后续步骤没有影响。
注意：如果处理无细胞样品，请确保在使用前每100μlBufferVXL添加1μg载体RNA。
如果处理富含细胞的样品（如全血和组织），请勿添加载体RNA。
4.在20-25°C孵育15分钟。
5.短暂离心2毫升管以从所述盖的内部取出液滴。
6.向样品中加入350μl缓冲液ACB，盖上盖子，通过脉冲涡旋充分混合。
确保在使用前将异丙醇加入Buffer ACB浓缩液中。
7.短暂离心2毫升管以从盖的内部去除液滴。
8.将来自步骤7的裂解物转移到置于2ml收集管中的QIAamp Mini柱中，不润湿边缘。
盖上盖子，以6000 x g（8000 rpm）离心1分钟。
将QIAamp Mini柱放入干净的2 ml收集管中，丢弃含有滤液的收集管。
如果裂解液在离心后没有完全通过色谱柱，则再次以更高的速度（高达20,000 x g; 14,000 rpm）离心，直到QIAamp Mini色谱柱为空。
9.打开QIAamp Mini色谱柱，加入600μ
lBufferAW1，不要弄湿边缘。
盖上盖子，以6000 x g（8000 rpm）离心1分钟。
将QIAamp Mini柱置于干净的2 ml收集管中，丢弃含有滤液的试管。
10.打开QIAamp Mini色谱柱，加入600μlBufferAW2，不要弄湿边缘。
盖上盖子，以6000 x g（8000 rpm）离心1分钟。
将QIAamp Mini柱置于干净的2 ml收集管中，丢弃含有滤液的试管。
11.全速离心（20,000×g; 14,000rpm）2分钟以干燥膜。
12.将QIAamp Mini柱置于干净的1.5 ml微量离心管（未提供）中，丢弃含有滤液的收集管。
打开QIAamp Mini柱，在膜中心加入50-150μlBufferAVE。
盖上盖子，在室温（15-25°C）下孵育1分钟。
全速离心（20,000 x g; 14,000 rpm）1分钟。
重要：确保洗脱缓冲液平衡至室温。
如果以小体积（<75μl）进行洗脱，则必须将洗脱缓冲液分配到膜的中心，以完全洗脱结合的RNA和DNA。
洗脱体积灵活，可根据下游应用的要求进行调整。
为了降低噪音，洗脱的离心速度可以设定为6000×g。
如果这样做，则回收的洗脱液体积将比施加到柱上的洗脱缓冲液体积小约5μl。
