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苜蓿cDNA—AFLP反应体系的建立和优化

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Ａｂ ｔ ａ ｔ ｃ ｓｒ ｃ ： ＤＮＡ —Ａ ＬＰ ｒ ａ ｔｏ ｙ ｔ ｍ ｏ ｆ ｆ ｓ ｅ ｔｂ ｉｈ ｄ ｗｉ ｈ ｅ ｖ ｓ ｏ ｄ ｆｅ ｌ ｔｒｌ ’ ｅ ｃｉｎ ｓ ｓｅ ｆｒ ａ ａ ａ ｗａ ｓａ ｌｓ ｅ ｔ ｔ ｅ ｌ ａ ｅ ｆ ｍｏ ｉ ｄ ｍａｅ ｓｅ ｉ ｌ ｌ ｈ ｉ ｅ ｌｎ ａ ｄ ｃｅ ｒ ｆ ｅ ｐ ｎ ｓ ｃｒ ｍ ｒ ｂｔｉ ｅ ．Ａ ｅ ｅ ｆ ｐ ｏ ｅ ｕ ｅ ｒ ｈ ｉ ｅ， ｎ ｌ ａ ｎｇ ｒ ｒ ｔ ｐｅ ｔｕ ｗｅ ｅ ｏ ａ ｎ ｄ ｉ ｉ ｓ ｒ ｓ ｏ ｒ ｃ ｄ ｒ ｓ ｗｅ ｅ ｔ ｅ ＲＮＡ ｘｒ ｃ ｉｎ， ｅ ｅ ｓ ｉ ｅ ｔａ ｔ ｏ ｒ ｖ ｒｅ ｔａ ｓ ｒｐ ｉｎ， ｉ ｅ ｔｏ ｌｎ ｓ， ＣＲ ｍｐｌ ｃ ｔｏ ｎｄ ｇ ｌｅ ｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓ Ｔ ｅ ｕ ｔ ｒ ｓｆ ｌ ｗｓ： ＤＮＡ ｓ ｒ ｎ ｃ ｔｏ ｄ ｇ ｓｉｎ，ｉ ｋ Ｐ ｉ ａ ｉ ａｉｎ ａ ｅ ｌｃ ｒ ｐ ｏ ｅ ｉ． ｈｅｒ ｓ ｌｓｗｅ ｅ ａ ｏ ｌ ｉ ｆ ｏ ｃ ｗａ
Ｋｅ ｒ ｓ： ａ ｆｌａ；ｅ ｙ ｗｏ ｄ ｌａｆ ＤＮＡ－ ＡＦＬＰ；ｌ ａ ；ｓ ｓｅ ｏ ｔ ｚ ｔｏ ｅ ｆ ｙ ｔ ｍ ｐ ｉ ａｉ ｎ ｍｉ
苜蓿 （ ｄｃｇ ａｉ ） 我 国最 重要 的栽 培牧 草 ， Ｍｅｉ ｏｓｔａ 是 ａ ｖ
ｍ ｒｈｓ 技 术 是 Ｂ ｃｅ 等 于 １ ９ ｏｐ ｉ ｍ） ａｈ ｍ ９ ６年 以 Ａ Ｌ Ｆ Ｐ为 基
Ｃ ｎ ｅ ｔｐ ｏ ｕ ｔ ． ｘ ｉ ｔ ｈ ０／ｌｐ ｅ ａ ｌ ｃ ｔ ｎ Ｓ ｓｅ ｆ ｒｐ ｅ ａ ｌ ｃ ｔ ｎ Ｔ ｅ ｅｆ ｃ ｓ ｔ ｅ ｂ ｓ ｏ ｎ ｃ ｒ ｄ ｃ ０／ｌ ｎ ｏ ｔ ｅ ２ ｚ ｒ — ｍｐ ｉ ａ ｉ ｙ ｔ ｍ ｒ — ｍｐ ｉ ａｉ ． ｈ ｆ ｔｗａ ｈ ｅ ｔ ２ ｉ ｆ ｏ ｏ ｉ ｆ ｏ ｅ ｔ ａ ｈ ｒ — ｍｐ ｉ ｅ ｒ ｄ ｃ ｓ ｄ ｌ ｔｄ ２ － ｌ ｈ ｎ ｗ ｓ ｓ ｌｃ ｉｅ ａ ｌ ｅ ． ｈ ｔ ｅ ｐｅ ａ ｌ ｄ ｐｏ ｕ ｔ ｔ ｉ ｆ ｗａ ｉ ｅ ０ ｆ ｄ ｔ ｅ ａ ｅ ｅ ｔ ｍｐ ｉ ｄ ｕ ｏ ｖ ｉ ｆ
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３ 内蒙古 巴彦 淖尔 市农 业气 象试 验 站 ， 内蒙 古 临河 ０５０ ） ． １０ ０
摘要 ： 以改 良的苜蓿雄性 不育 系叶片为材料 ， 通过 Ｒ Ａ提 取、 转录、 Ｎ 反 酶切 、 链接 、 Ｃ Ｐ Ｒ扩增、 凝胶 电泳等 系列程序 的摸 索 和优 化 ， 立 了适 宜苜 蓿 ｅ Ｎ Ａ Ｌ 建 Ｄ Ａ— Ｆ Ｐ的反 应体 系， 并得 到 了清 晰可 辨的 ｃ Ｎ Ａ Ｌ Ｄ Ａ・Ｆ Ｐ指 纹 图谱 。结 果如 下 ：Ｄ Ａ 经 ｃＮ Ｅ ｏ Ｍｓ Ｉ完全酶切后 ，６℃连接 １ ；０Ａ预 扩增体 系中加入连接产物 ２ ０ｚ 较 适宜 ， ｃＲ Ｉ和 ｅ １ ５ｈ２ ／ ．／ ｌ 预扩增产物稀释 ２ ０倍后进
Ｅ ｔｂ ｉｈ ｎ ｎ ｐ ｉ ｚ ｔ ｎ ｏ ｓａ ｌ ｍｅ ｔａ ｄ ｔ ｓ ｍｉａｉ ｆ ｏ
ｃ ＤＮＡ— ＡＦＬ ａ ｔｏ ｙ ｔｍ ｏ ｆ１ａ Ｐ Ｒｅ ｃｉｎ Ｓ ｓｅ ｆｒＡｌ ｆ ａ
ＣＡＩ Ｌｉｙａ ， Ｓ ｎ ｌｎｇ － ｎ ＨＩ Ｆｅ ｇ—ｉ ， ＬＩＺｈｉｙｏ ， ＧＡＯ － ｎｇ Ｃｕｉｐ ｎｇ ＧＡＯ ｉｘａｎ － ｉ ， Ｆｅ － ｉ ｇ
研究报告
蔡丽艳 等 ： 苜蓿 ｅ Ｎ ． Ｆ Ｐ反应体系 的建立和优化 Ｄ ＡＡ Ｌ
苜蓿 ｅ Ｎ Ａ Ｌ Ｄ Ａ— Ｆ Ｐ反 应 体 系 的建 立 和 优 化
蔡丽艳 石凤翎 李志勇 ， 高翠萍 高飞翔。 ， ， 。 （． １ 中国农业科学院草原研究所 ， 呼和浩特 ０ ０ １ ； １００ ２ 内蒙古农业大学生态环境学院 ， 呼和浩特 ００ １ ； ． １０ ９
行 选择 性 扩 增 效 果 最 佳 。
关键词 ： 苜蓿 ；ｃ Ｎ － Ｆ Ｐ Ｄ Ａ Ａ Ｌ ；叶片 ； 体系优化
中图分类 号 ： Ｓ ５ ． ； Ｓ １ ５１ ７ ２ ８ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ： １０ —４ ０ （０ １０ －０ １ ５ ０ １ ７ ５ ２ １ ） ８０ ０ － ０

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cDNA-AFLP技术及其在药用植物基因表达研究中的应用展望

cDNA-AFLP技术及其在药用植物基因表达研究中的应用展望

胞 内只有 １ ％ 的基 因得 以 表 达 ，而 这些 基 因 的表 达 ０
酶 反转 录合 成 ｃ Ｎ Ｄ Ａ第 １ ，Ｒ Ａ酶 Ｈ 切割 ｅ Ｎ ／ 链 Ｎ Ｄ Ａ
Ｒ Ａ杂交 体系 中的 Ｒ Ａ，造 成 切 口和缺 口，Ｒ Ａ片 Ｎ Ｎ Ｎ
段 就作 为 ｃ Ｎ Ｄ Ａ第 ２链 的 引物 ，在 大肠 杆 菌 Ｄ Ａ 聚 Ｎ 合 酶 Ｉ 作 用 下 合 成 第 ２链 ，连 接 酶 将 缺 口封 闭 。 的 得 到双 链 ｃ Ｎ Ｄ Ａ后 ，用 识 别 序 列 分 别 为 ６ ｐ和 ４ ｐ ｂ ｂ 的 ２种 限制 性 酶 酶 切 ，酶切 片段 加 上 人 工 接 头 ，再
转 录组 学 （ｒ ｓｒ ｔｍ ｃ ） ｉ ｇ等 在 １９ ｔ ｎｃｉ ｏ ｉｓ 。Ｌａ ａ ｐ ｎ ９ ２年 建
利用与接头序列互补 的引物进行 预扩增和选择性 扩 增 ，通 过 聚丙烯 酰胺 凝胶 电泳 显示 差 异性 转 录产 物 。
预 扩增 过程 为 选 择性 扩 增 提供 了充 足 的模 板 ，所 以 ｅ Ｎ —Ｆ Ｐ所 用 的原 始 材 料 量 极 少 ，每 份 样 品 约 Ｄ ＡＡ Ｌ １０～ ０ ｍ ，因而 可 对 微量 样 品进 行 精 确 筛 选 ，一 ０ ２０ ｇ
于光 ，段 金 廒
（ 南京 中医药大学江苏省方剂研究重点实验 室， 江苏 南京 ２ ０ ４ ） １０ ６
［ 摘要 ］ 简要 阐述 ｅ Ｎ ． Ｆ Ｐ技 术原理 ，讨论操 作过程 中可能 出现 的问题 和技 术关 键 ，展望 该技术 在药用 Ｄ Ａ ＡＬ 植物研究 中的潜在应用价值 。 ［ 关键词 ］ ｅ Ｎ Ａ Ｌ ；药用植物 ；差异表达 Ｄ Ａ—Ｆ Ｐ
般每对引物组合可检测 ５ ８ 条可识别带 ，可以有 ０— ０
红三叶AFLP体系的建立及优化

红三叶AFLP体系的建立及优化

摘要：采用正交设计和单因素试 验 相 结 合 的 方 法，以 红 三 叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲）高 感 白 粉 病 品 种 岷 山红三叶与抗白粉病新品系（甘农 ＰＲ１）杂交产生 Ｆ１代作为试验材料，对红三叶 ＡＦＬＰ 反应中７个因 素（ＤＮＡ 浓度，酶切时间，两酶（犈犮狅ＲＩ，犕狊犲Ｉ）浓度，预扩增产物稀释 倍 数，２×ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ用 量，引 物组合）进行优化试验。建立了适合红三叶稳定且多态性高的最佳 ＡＦＬＰ 反应体系：９０ｎｇ／μＬ ＤＮＡ 模 板、５ｈ酶切、８Ｕ犈犮狅ＲＩ、６Ｕ犕狊犲Ｉ、３０倍稀释预扩增产物、１０μＬ２×ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ。优化的 ＡＦＬＰ 反 应体 系 在 红 三 叶 的 验 证 中 表 现 出 良 好 的 稳 定 性 和 重 复 性，为 进 一 步 进 行 红 三 叶 种 质 鉴 定、遗 传 图 谱 构 建 、基 因 定 位 和 遗 传 多 样 性 的 分 析 奠 定 了 技 术 基 础 。 关键词：红三叶；ＡＦＬＰ 分子标记；体系优化 中 图 分 类 号 ：Ｓ５４１ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００９５５００（２０１８）０２００８９０８
ＲＡＰＤ 结 合 而 成 的 一 种 新 的 分 子 标 记 技 术，具 有 ＲＦＬＰ 标记和 ＲＡＰＤ 标记的优点，有“最有力的分子标 记”或“下一代分子标记”的称号 。 ［７］ 因 其 高 多 态 性，可 靠，高效［８］，ＤＮＡ 用量少，检测率高［９］，重复性高，加上 选择为中性［１０］等许多 优 点，ＡＦＬＰ 技 术 普 遍 应 用 于 生 物研究领域。 近 年 来，ＡＦＬＰ 技 术 在 牧 草 种 质 鉴 定 方 面 的 应 用 发 展 迅 速，在 紫 花 苜 蓿 （犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻 狏犪）［１１］，燕 麦 （犃狏犲狀犪狊犪狋犻狏犪）［１２］，狗 牙 根 （犆狔狀狅犱狅狀犱犪犮 狋狔犾狅狀）［１３］，老 芒 麦 （犈犾狔犿狌狊狊犻犫犻狉犻犮狌狊）［１４－１５］，扁 蓿 豆 （犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）［１６］，鸭 茅 （犇犪犮狋狔犾犻狊犵犾狅犿犲狉犪狋犪）［１７］ 等牧草的鉴 定 中 均 有 报 道。 孟 丽 娟［１８］通 过 对 来 自 美
割手密AFLP分子标记技术体系建立与优化

割手密AFLP分子标记技术体系建立与优化

割手密AFLP分子标记技术体系建立与优化刘许辉;段维兴;刘新龙;杨海霞;高轶静;罗霆;宋焕忠;张革民【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2013(044)004【摘要】[目的]建立和优化割手密AFLP分子标记技术体系,为割手密遗传多样性分析、遗传图谱构建提供技术支持.[方法]以广西割手密GXS87-16、GXS85-30、GXS79-9、GXS96、GXS112、GXS212为材料,利用改良SDS法提取DNA,并用EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ酶切,连接接头后,采用正交试验设计对影响预扩增反应和选择性扩增反应的主要成分如MG2+、模板DNA、引物、dNTP、Taq聚合酶浓度进行优化.[结果]样品DNA用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ各3U于PCR仪过夜可完全酶切.经正交设计优化,较佳的预扩增体系包含0.4 μL dNTPs(20mmol/mL),1.6 μL Mg2+(25mmol/mL),2.0 μL EcoR Ⅰ-P(5 pmol/mL),2.0μL Mse Ⅰ-P(5 pmol/mL),1 UTaq酶(1 U/μL),DNA模板稀释10倍；选择性扩增体系包含0.4 μL dNTPs(20 mmol/mL),0.8 μL Mg2+(25 mmol/mL),1.0 μL EcoR Ⅰ-AAG(6 pmol/mL),1.0μL Mse Ⅰ-CAG(6 pmol/mL),3U Taq酶(1 U/μL),DNA 模板稀释20倍.以对优化反应体系扩增获得的PCR产物用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后,可获得清晰的多态性指纹图谱.[结论]建立的割手密AFLP分子标记技术体系具有扩增条带清晰、多态性丰富的特点,可为构建割手密高密度遗传图谱提供技术支持.【总页数】6页(P552-557)【作者】刘许辉;段维兴;刘新龙;杨海霞;高轶静;罗霆;宋焕忠;张革民【作者单位】广西大学农学院,南宁530005;广西农业科学院甘蔗研究所,南宁530007;云南省农业科学院甘蔗研究所,云南开远661600;广西大学农学院,南宁530005;广西农业科学院甘蔗研究所,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所,南宁530007;广西农业科学院甘蔗研究所,南宁530007【正文语种】中文【中图分类】S566.1【相关文献】1.利用AFLP分子标记技术构建花莲核心种质资源 [J], 杨美;付杰;向巧彦;刘艳玲2.割手密AFLP分子标记技术体系建立与优化 [J], 刘许辉;段维兴;刘新龙;杨海霞;高轶静;罗霆;宋焕忠;张革民;3.枣cDNA-AFLP技术体系建立与优化 [J], 赵锦;李庄;宋蓓;刘孟军4.红豆杉AFLP分子标记技术体系的建立及应用 [J], 史正文5.萝卜抽薹性研究的AFLP体系建立与优化 [J], 张美霞;林多因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

【国家自然科学基金】_银染技术_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802

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科研热词 推荐指数 双向电泳 3 cdna-aflp 3 银染 2 蛋白质组 2 蛋白质 2 荧光原位杂交 2 扩增片段长度多态性 2 优化 2 麦长管蚜 1 雄激素受体 1 链酶亲和素 1 银染显色 1 金标银染 1 遗传距离 1 质谱法 1 谷胱苷肽-s-转移酶 1 西藏少数民族 1 表达模式 1 血管痉挛,颅内 1 血清 1 蛋白质组学 1 苹果 1 自身基因组原位杂交 1 胡杨 1 肺肿瘤 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 羧基化碳纳米管 1 细胞色素氧化酶亚单位ⅰ 1 线粒体dna 1 纳米金 1 系膜细胞 1 系统发生树 1 种类鉴定 1 硬化性血管瘤 1 短串联重复序列(str) 1 番茄 1 电泳,凝胶,双向 1 电泳,凝胶 1 生物素 1 生物电子 1 生物电化学传感器 1 甘薯 1 甘蔗 1 琼脂糖凝胶电泳 1 玉米根系分泌物 1 玉米 1 法医昆虫学 1 气阴两虚 1 桃 1 果实 1 条件优化 1 杉木 1
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94
物种多样性 激活前培养时间 氧化性应激 毒性当量 橡胶树 核移植 枸杞属 无精子症 改良方法 指纹图谱 总蛋白提取 性别 快速检测 微卫星不稳定性 微卫星dna 微卫星 影响因素 异构酶类 富士 多结节肝癌 多环芳烃受体 塑料 基因组dna 四氯二苯并二嘑英 叶片 凝胶 免疫电泳 克隆起源 光谱法,质量,基质辅助激光解吸电离 体细胞 二嘑英类化合物 临床意义 中国对虾 丛枝菌根真菌 ssr s-sap pcr扩增 iga肾病 cdna-aflp分析体系 cdna-aflp体系 cdna-aflp aflp的优化与建