ABO及RhD血型鉴定试验标准操作规程
(一)检验目的
检测红细胞表面ABO血型抗原、RhD抗原及血清(或血浆)中抗A、抗B抗体，确定受检者ABO及RhD血型。
(二)检验原理
1.手工试管法、玻片法或纸板法利用标准IgM抗A／B血清鉴定红细胞表面ABO抗原即正定型，利用已知ABO 血型反定型红细胞鉴定同一标本血清(或血浆)中的抗A／B 抗体即反定型，综合正反定型结果确定受检标本ABO血型；利用标准IgM抗D直接鉴定RhD血型。
2.微柱凝胶法ABO／RhD卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶颗粒中，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。
3.玻璃珠微柱法ABO／RhD卡的微管中装填有玻璃微珠和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，玻璃微珠具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过玻璃微珠，使其悬浮在玻璃微珠层的上端，未凝集的红细胞则可以通过玻璃微珠之间的微小空隙到达微管底部。
(三)适用范围
适用于手工、半自动、全自动ABO血型及RhD血型鉴定试验。
(四)设备性能参数
各种血型检测系统性能指标参见相应血型检测系统说明书。
(五)器材与试剂
1.器材WADiana全自动血型配血系统、SWING-SAXO 血型配血系统、Techno全自动血型配血系统、Othro AutoVue Innova全自动血型配血系统、B600-A型低速离心机、KA-2200血清学专用离心机、阅片灯箱、塑料软试管、塑料硬质试管(100m m×12mm和75m m×l2mm)、血型鉴定专用纸板、玻片、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。
2.试剂Diana DG Gel ABO-CDE血型卡、DiaMed ABO／RhD血型卡、OTHROBiovueABO／RhD血型卡、2％氢氧化钠溶液、生理盐水、抗A／B标准血清、抗D标准血清、3％～5％反定型试剂红细胞、1％反定型试剂红细胞。
(六)标本要求
EDTA-K2或EDTA-K3抗凝静脉血≥3ml经B600-A型离心机在1760g条件下离心5分钟，离心后无溶血及明显乳糜。紧急情况下可以使用抗凝动脉血。
(七)校准步骤
各类血型配血系统的校准操作过程分别见《WADiana全自动血型配血系统标准操作规程》《SWING-SAXO血型配血系统标准操作规程》《Techno全自动血型配血系统标准操作规程》《Othro AutoVue lnnova全自动血型配血系统标准操作规程》。
(八)操作步骤
1.试管法
(1)ABO血型正定型试验：①取两支洁净试管，做好标记，按试管标记向试管中加入抗A、抗B血清各1滴；②向每管中各加入1滴3％～5％被检红细胞盐水(血清或血浆)悬液；③轻轻混合试管内容物，经KA-2200离心机在1000g条件下离心15秒；④结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；⑤记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。用ABO反定型试验进一步验证正定型结果。
(2)ABO血型反定型试验：①取两支洁净试管，做好标记，向每管中各加2滴被检血清(或血浆)。②按试管标记向试管中加入3％～5％A型、B型试剂红细胞各1滴。③轻轻混合试管内容物，经KA-2200离心机在1000g条件下离心15秒。④结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和
振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块。⑤记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。与正定型结果进行相互验证。⑥如果反应较弱，可将试管于室温(或4℃)放置5～10分钟，以促进弱抗体的反应，再离心观察结果。如果反应还是很弱可以增加血清
(或血浆)滴数，最多增加到6滴以加强反应。
(3)RhD血型鉴定试验：①取一支洁净试管，做好标记，加入抗D血清1滴；②向试管中加入1滴3％～5％被检红细胞盐水(血清或血浆)悬液；③轻轻混合试管内容物，经KA-2200离心机在1000g条件下离心15秒；④结果判断：将试管拿成锐角，缓慢倾斜，使液体通过细胞扣，当细胞不再附着在试管上时，继续缓慢地倾斜和振摇，直到形成均匀的细胞悬液或凝集块；⑤记录结果：记录观察到的凝集程度或溶血程度。
2.玻片法
(1)ABO血型正定型：①在标记的玻片上分别加1滴抗
A、抗B标准血清，再各加1滴红细胞悬液(按试剂说明书的要求配置受检者红细胞浓度)。②用干净的玻璃棒将红细胞悬液和试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖约20m m ×20mm的面积。③缓慢连续倾斜转动玻片2分钟，观察结果并记录。不要把玻片放在加热的表面物上，以防水份蒸发。
④结果判断：凝集或发生溶血为阳性结果；细胞混匀2分钟
后仍呈悬液状态的为阴性结果；对结果有怀疑，应用试管法重复实验。⑤注意事项：玻片试验不适用于ABO反定型试验；不要混淆玻片边缘干燥的红细胞与真凝集。
(2)RhD抗原定型试验：①在一块标记的干净玻片上加1滴IgM或抗D标准血清。②在第二块标记的玻片上加1滴合适的对照试剂。③在每块玻片上加1滴受检者40％～50％红细胞悬液。④用玻棒将细胞悬液试剂充分混合，并把混合物均匀涂开，使其覆盖玻片20m m×20mm面积。⑤把两块玻片同时放在观察箱上，缓慢连续倾斜转动并观察凝集。多数试剂要求试验必须在2分钟内判读结果。⑥结果判断：当含有抗D血清的玻片上出现红细胞凝集而对照玻片上是均匀红细胞悬液时为阳性结果；当含有抗D试剂的玻片和对照玻片上都是均匀的细胞悬液时，提示是阴性结果，如果要进行RhD阴性确认试验，可参照《RhD血型确证试验(卡式抗人球法)标准操作规程》；如对照玻片上出现凝集，在未经进一步试验之前，不能解释为阳性结果；玻片边缘附近的红细胞干涸不应该混淆为凝集。
3.纸板法(ABO血型正、反定型及RhD定型同时鉴定)
(1)取洁净五孔血型鉴定专用纸板，做好姓名标记。
(2)按纸板标识向每孔中分别加入相应试剂抗A、抗B、抗D血清各1滴以及受检者血清各2滴。
(3)各孔中分别加入受检者红细胞适量及相应所需3％～
