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2019年第7期 吉林畜牧兽医·经验交流·JingYan JiaoLiu口蹄疫病毒抗体检测白 翠，王 楠，王 晶，马晓媛，于钦磊吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062摘 要：口蹄疫是一种急性、高度接触性、烈性的传染病，是由口蹄疫病毒引起的，常常发生在偶蹄动物，偶尔也见于人和其它动物。
世界动物卫生组织已经将该病列为法定申报传染病，我国将其列为一类动物疫病。
我国主要通过实施强制免疫来预防控制该病，疫苗免疫之后所产生的抗体水平是评价免疫效果的重要手段，也可以根据免疫后的 效果来制定合理免疫程序。
本实验室主要通过口蹄疫液相阻断和3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒来进行抗体检测。
关键词：口蹄疫；ELISA；抗体检测我国口蹄疫病毒流行毒株主要为A型、亚洲I型和O型，其中O型口蹄疫病毒基因型众多，流行广泛，严重危害畜牧养殖业发展[1]。
1 液相阻断ELISA方法进行抗体检测液相阻断是应用双抗体夹心法，其试验过程是抗原吸附在载体上，也就是我们常说的包被，包被后加入待测抗体，反应后加相应酶标记抗体，生成抗原抗体复合物，再与底物发生显色反应。
最后通过酶标仪的光谱吸收，测量OD值，计算抗体的量。
本实验室的试剂盒主要是使用兰州兽医研究所（兰兽研）研制开发的，该试剂盒与其它同类型试剂盒相比，许多项指标都已达到了世界口蹄疫参考实验室的同类产品水平，符合率极高。
液相阻断的难点重点在于被检血清的稀释倍数，这个在试剂盒说明书上有具体操作步骤，实验室操作人员可根据说明书进行10份或20份样品的操作。
2 3ABC非结构蛋白抗体检测经抗原纯化过的口蹄疫疫苗，去除了绝大部分3ABC非结构蛋白[2]，因此，用灭活疫苗免疫的健康动物体内正常不会有3ABC非结构蛋白抗体产生，而自然感染的动物体内由于免疫频率的增加和免疫剂量的加大，不仅产生了结构蛋白而且也产生3ABC非结构蛋白抗体。
所以，用该方法可以区分自然感染和免疫抗体。
动物疫病口蹄疫监测实施方案一、监测目的了解口蹄疫病原感染分布情况及高风险区域的发病情况，跟踪监测病毒变异特点与趋势，查找传播风险因素。
证明免疫无疫区状态。
评估畜群免疫效果，掌握群体免疫状况。
同时，开展猪塞内卡病毒A型(SenecavirusA,SVA)监测，评估危害性。
二、监测对象猪、牛、羊、鹿等偶蹄类动物。
三、监测范围全县。
猪、牛、羊、鹿等偶蹄类动物的种畜场、规模饲养场、散养户、活畜交易市场、屠宰场、无害化处理厂等。
注：散养户以一个自然村为一个监测采样的流行病学单o四、监测时间免疫抗体监测：每半年进行一次集中监测，定点监测根据实际情况安排。
病原监测：每半年进行一次集中监测，每季度进行一次定点监测。
同时，按照国家口蹄疫参考实验室具体采样时间安排，配合做好重点区域重点场所采样工作。
五、监测方式（一）被动监测任何单位和个人发现猪、牛、羊、鹿等偶蹄动物或野生动物出现水泡、跛行、烂蹄等类似口蹄疫的症状，应及时向当地兽医主管部门、动物卫生监督机构和/或动物疫病预防控制机构报告，动物疫病预防控制机构应及时采样进行监测。
（二）主动监测1.病原监测采用先抽取场群，在场群内再抽取个体的抽样方式开展监测釆样。
选择场群时要考虑猪、牛、羊、鹿等偶蹄类动物的种畜场、规模饲养场、散养户、活畜交易市场、屠宰场的比例。
2.抗体监测选择场群时要综合考虑猪、牛、羊、鹿等偶蹄类动物的种畜场、规模饲养场、散养户、活畜交易市场及屠宰场的比例。
六、监测内容和数量重点选择辖区内种畜场、奶牛场和规模养殖场开展口蹄疫病原学检测和免疫抗体检测，每次每个场至少釆集样品30份，很多于6场（村）次。
在开展上述监测外，应开展月度常规监测，监测内容和数量根据实际情况确定。
监测数据及时按程序上报监测信息系统。
七、检测方法（一）病原检测对牛羊食道-咽部分泌物（0P液）、猪颌下淋巴结或扁桃体，采用RT-PCR方法或实时RT-PCR方法检测口蹄疫病原。
（二）非结构蛋白抗体检测采用非结构蛋白（NSP）抗体ELISA方法进行检测。
试分析提高猪口蹄疫免疫抗体合格率的措施猪口蹄疫是一种由病毒引起的急性传染病，主要侵袭猪的口蹄部位，给猪的生产和养殖业造成了巨大的危害。
为了有效控制和预防猪口蹄疫的蔓延，提高猪的免疫抗体合格率，各级政府和养殖业者都在不断探索和实践。
本文将从疫苗接种、疫苗质量、临床防治等方面进行分析，谈论提高猪口蹄疫免疫抗体合格率的措施。
猪口蹄疫病情严重影响了猪的生产和养殖业，防控工作是非常重要的。
要提高猪口蹄疫免疫抗体合格率，首先需要做好疫苗接种工作。
疫苗接种是预防猪口蹄疫的一项重要措施，对于提高猪的免疫抗体合格率来说至关重要。
需要养殖业者和政府部门加强对疫苗接种工作的监督和指导，确保疫苗接种的规范和及时性。
要提高猪口蹄疫免疫抗体合格率，需要确保疫苗的质量。
疫苗的质量是影响疫苗接种效果的关键因素。
需要加强对疫苗生产企业的监管，严格把关疫苗的生产质量，确保疫苗符合标准和规范，提高疫苗的保护效果。
养殖业者在购买疫苗时也要选择正规的、有资质的疫苗生产企业的产品，确保疫苗的质量和效果。
还需要加强对猪口蹄疫的临床防治工作。
在疫情爆发或疫苗接种不足的情况下，需要对疫情严重的区域进行临床防治，及时控制疫情的蔓延，保护生猪的健康。
需要加强对猪口蹄疫的监测和预警工作，及时发现和报告疫情，采取有效的隔离和治疗措施，避免疫情的扩散和扩大。
提高猪口蹄疫免疫抗体合格率是一个长期而艰巨的任务，需要政府部门、养殖业者和疫苗生产企业的共同努力。
只有加强疫苗接种工作、确保疫苗质量、加强临床防治工作，才能有效提高猪口蹄疫免疫抗体合格率，保障猪的健康和养殖业的稳定发展。
希望全社会都能高度重视这一问题，共同努力，共同为猪口蹄疫的预防和控制做出贡献。
一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。
现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。
1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。
病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。
中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。
病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。
2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。
灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。
当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。
然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。
中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。
2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。
目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。
硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。
2020年第10期猪口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性疾病,主要侵害猪的蹄部、口部及乳房等,仔猪多伴有心肌炎。
该病不仅造成重大的经济损失,还严重制约畜牧业的健康发展,甚至威胁着国家声誉和人类食品卫生安全。
因此口蹄疫的防控对畜牧业的健康发展有着重要意义。
规模场中通过采集猪血清检测血液中口蹄疫抗体的技术手段,可以有效的预防和掌握口蹄疫的流行动态,再配合有效的猪场生物安全措施,可降低口蹄疫的感染风险。
笔者对采集的某地区规模化育肥场的猪血清进行了抗体检测和结果分析,为制定口蹄疫的防控策略提供科学依据。
1血清采集及检测秋季免疫后1个月内,选择5个免疫口蹄疫多价灭活苗的规模化育肥场,存栏4000头左右。
对每个场随机选取100头育肥猪进行血液样品采集,采血部位为前腔静脉,血量为5m L 左右,共采集500份血液样品,样品按照不同养殖场进行分类,用油性记号笔在采血器表面标记样品并编码。
将装血样的采血管斜置或平放静置30m i n ,待血清析出后,送至实验室,离心分离血清,备用。
然后使用采购自中国农业科学院兰州兽医研究所的口蹄疫O 型液相阻断ELI SA 抗体检测试剂盒检测血清中猪口蹄疫的抗体,并记录结果。
2结果与分析使用口蹄疫O 型液相阻断ELI SA 抗体检测试剂盒检测血清中猪口蹄疫抗体,结果见表1。
由表1得知,5个规模化育肥场O 型口蹄疫的抗体合格率为93%。
其中,B 育肥场O 型口蹄疫免疫合格率高达到98%,在所调查育肥场中免疫保护效果最好;D 场O 型口蹄疫免疫合格率为87%,免疫保护效果率相对较低。
剩余A 、C 、E3个规模化育肥场O 型口蹄疫免疫合格率都在90%以上,5个规模化育肥场O 型口蹄疫的免疫保护率均达标。
免疫抗体监测是对动物的健康状况进行反馈的一项重要工作,猪作为口蹄疫的放大器,对口蹄疫病毒极为敏感,对猪群血清样品的检测能反映口蹄疫在易感家畜中的感染情况。
本次随机抽检了的5个规模化育肥场,从检测结果看,检测的500份血清样品口蹄疫抗体合格率,达到了农业部免疫抗体合格率70%以上的规定。
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，通过牛、羊、猪等偶蹄动物传播，呈现明显发热症状，并具有高度接触和远距离快速传播的动物疫病。
该病的发病率接近100%，成年动物的死亡率较低且一般可控。
仔猪主要因出现急性胃肠炎和致死性心肌炎，死亡率高达70%左右，断奶前幼畜死亡率可高达100%。
我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控。
由于口蹄疫病毒容易发生变异导致新毒株不断出现，所以，在对动物进行疫苗免疫时，应了解当地口蹄疫流行情况，免疫与当地流行毒株匹配的疫苗，才能有效防控口蹄疫，使疫苗发挥更大的作用。
免疫抗体是衡量疫苗免疫效果的重要指标。
目前，国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA方法来对口蹄疫疫苗免疫效果进行评价。
研究与实践表明，口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性，与攻毒保护有很好的相关性，现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。
液相阻断ELISA方法专为检测FMD全病毒抗体设计，针对完整病毒粒子的抗原位点进行抗体定性定量检测，通过对被检血清的倍比稀释，定量测定血清中抗体含量的高低，从而真实反映出免疫后机体抵御病毒侵入的能力。
疫苗免疫以后，为了掌握疫苗免疫对猪群的保护力，需要抽检样品检测抗体，对免疫水平进行评价。
一、材料与方法（一）疫苗某企业猪口蹄疫O、A型二价灭活疫苗。
（二）实验器材单道、12道移液器若干，96孔U型反应板若干，37℃恒温生化培养箱、100ml 量筒、iMark-酶标仪。
（三）血清样品福建某养殖场提供50日龄、60日龄、80日龄、110日龄、140日龄商品猪血清各20份。
该规模化养殖场口蹄疫疫苗的免疫程序为：母猪一年普免三次；仔猪90日龄免疫一次。
（四）检测试剂盒口蹄疫O型、A型液相阻断抗体检测试剂盒，购自兰州兽研生物有限公司。
（五）实验方法及判定标准采用液相阻断ELISA测定免疫动物血清中口蹄疫特异性抗体，具体方法如下：1.待检血清稀释按50ul每孔用PBST做1:16开始的2倍稀释至1:128，每孔加入50ul稀释至规定浓度的口蹄疫病毒灭活抗原，对照孔加100ul，振荡混匀，4℃过夜。
高致病性禽流感和口蹄疫等主要动物疫病免疫抗体监测及流调方案为切实掌握高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性猪蓝耳病等主要动物疫病流行规律和疫情动态，及时发现疫情隐患，提高重大动物疫情预警预报能力，按照集中监测和日常监测相结合原则，根据自治区兽医局下达的202**年监测和流调任务结合***区防疫员工作效果需要，制定本方案。
***区动物疾控中心具体负责组织、实施禽流感、口蹄疫、猪瘟、新城疫、羊小反刍兽疫、猪蓝耳病的免疫抗体监测和病原学监测拭子的采集送检及流调工作，兼顾牛结核病的监测工作，社会化组织配合开展、完成动物疫病每月流调工作。
及时汇总分析和通报监测结果，并将监测结果按时上报自治区动物疾病预防控制中心。
(一)高致病性禽流感免疫抗体监测方案1.监测范围:不同年龄、品种的鸡、鸭、鹅和其它家禽，重点对种禽场、商品禽场、活禽市场等家禽进行监测。
2.监测时间:春秋进行两次集中监测，春季集中监测在5月底前完成，秋季集中监测在11月底前完成。
日常监测根据实际情况安排。
3.监测数量:202**年本级兽医实验室的监测采样原血数量初步定为100份。
4.检测方法、判定标准方法:血凝抑制试验。
判定:灭活疫苗，家禽免疫后21天，HI抗体效价≥24为免疫合格。
(二)口蹄疫免疫抗体监测方案1.监测范围:不同年龄、品种的猪、牛、羊。
重点对种畜场、规模饲养场家畜进行监测。
2.监测时间:春秋进行两次集中监测，春季集中监测在5月底前完成，秋季集中监测在11月底前完成。
日常监测根据实际情况安排。
3.监测数量:202**年本级兽医实验室原血采样数量初步定为猪、牛、羊各为100份。
4.检测方法、判定标准方法:O型口蹄疫用正向间接血凝试验或液相阻断ELISA。
判定:正向间接血凝试验，免疫21天抗体效价≥25为免疫合格;液相阻断ELISA，免疫21天抗体效价≥26为免疫合格。
(三)猪瘟免疫抗体监测方案1.监测范围:不同年龄、品种、用途、饲养方式的猪。
