铁皮石斛原球茎形态发生和NAC家族的生物信息学分析

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析目的：为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。

方法：以SMART（switching mechanism at 5′ end of RNA transcript）方式合成全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA 文库。

结果：该文库重组率为93.9%，文库滴度1.3×106 cfu·mL-1，插入片段平均大小1.5 kb 左右。

随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序，通过生物信息学分析，获得150个单一序列，其中147个序列与相应的同源蛋白匹配，GO（gene ontology）分类表明这些序列参与各种生化途径。

8个序列包含了完整编码框，可判断为全长基因。

结论：成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA 文库，为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。

标签：铁皮石斛；均一化；cDNA 文库；序列分析铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物，具有独特的药用价值，为我国名贵中药材。

铁皮石斛以其茎入药，其主要药用成分是石斛多糖、石斛碱、石斛次碱及多种氨基酸及微量元素，有生津益胃、清热养阴及增强人体免疫活性等功效，主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区[1]。

铁皮石斛种子小无胚乳，自身繁殖力低，在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，加上人为的过度采挖，其自然资源濒临枯竭[2]。

近些年铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术的突破性发展[3]，使得人工栽培铁皮石斛逐渐成为一个新兴产业。

由于对天然药物需求的不断增加，解决药物资源匮乏问题一直存在，从20世纪90 年代开始，药用植物功能基因的克隆呈现发展势头[4]。

通过确定药用植物的功能基因，发展药用植物的基因工程，获取药用植物的药用成分，这些都依赖药用植物的功能基因研究开发。

铁皮石斛RCA2基因克隆与生物信息学分析作者：蒋素华张燕王默霏王洁琼崔波来源：《广西植物》2017年第01期摘要：核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶是光合碳同化作用的关键酶，它对调节铁皮石斛Rubisco活性和光合速率具有直接的作用，对其进行基因等方面的研究，会对改变植物光合速率打下良好基础。

该研究以一年生铁皮石斛叶片为材料，采用 RTPCR和 RACE技术成功克隆了Rubisco活化酶（RCA）基因，并对其进行生物信息学分析。

结果表明：RCA基因全长1 730 bp，命名为RCA2（GenBank登录号KT205842），其中5′UTR 81 bp 、3′UTR 326 bp，开放阅读框1 323 bp，编码440个氨基酸，分子质量为48.53 kDa，等电点为6.19，包含Ploop NTPase 超家族基因结构。

氨基酸多重序列比对发现RCA2核苷酸序列与蝴蝶兰的相似性高达87%。

RCA2编码蛋白为亲水性蛋白；亚细胞定位于叶绿体基质；蛋白质二级结构分析，α螺旋占30.68%，延伸链占25.45%，不规则折叠占43.86%。

RCA2编码蛋白质的功能预测发现，RCA2在中间代谢起到了一个非常重要的角色。

该研究发现对铁皮石斛光合作用关键酶Rubisco 的分析可为其光合作用特性的发掘提供理论基础，并为提高温室大棚栽培效率提供理论依据。

关键词：铁皮石斛， RCA2基因，克隆，生物信息学分析中图分类号： Q949.71文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）01008007Abstract： Ribulose1，5bisphosphosphate carboxylase/oxygenase was a key enzyme of photosynthetic carbon assimilation， it had direct adjustive effects Rubisco activity and photosynthetic rate of in Dendrobium officinale， and laid a good foundation for changing plant photosynthetic rate by studying the gene. RCA gene was cloned from leaf of annual D. officinale using RTPCR and RACE， and was analyzed by bioinformatics. The results showed that the full length cDNA of RCA was 1 730 bp length， the cloned RCA gene was named RCA2（GenBank accession No. KT 205842）. It wa s contained a 5′untranslated region （5′UTR）（81 bp），3′UTR （326 bp），and an opening reading frame （ORF）（1 323 bp）， which could be translated into a 410aminoacid putative peptides with a molecular weight of 48.53 kDa and a theoretical pI of 6.19， with a domain of Ploop_NTPase superfamily. Multiple sequence alignment results showed that the homology of nucleotide sequence between the RCA2 and the reported Phalaenopsis genes was 87%. RCA2 protein was belong to hydrophilic protein，subcellular localization was in the chloroplast. The RCA2 protein secondary structure components showed that ahelix（h）， extended strand（e）， and random coil （c） accounted for 30.68%， 25.45% and 43.86%. RCA2 encoding protein function prediction showed that RCA2 played a very important rolein intermediary metabolism. This study of the key enzymephotosynthesis Rubisco in Dendrobium officinale provides the information for the research of the photosynthetic characteristics， and the basis for improving the efficiency of greenhouse cultivation.Key words： Dendrobium officinale， RCA2 gene， gene cloning， bioinformatics analysis铁皮石斛（Dendrobium officinale）属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生的草本植物，铁皮石斛含石斛多糖、石斛碱、双苄酚类、菲酚类等多种药效成分，是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种，具有滋阴清热、润肺止咳、益胃生津、明目强身等作用（Zhang et al，2000）。

铁皮石斛NAC基因的遗传转化铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.)是一种重要的兰科资源植物,具有很高的药用价值,又是一种名贵的花卉植物,由于野生铁皮石斛繁殖周期长,存活率低等,近几年来,有关兰科植物的组织培养和一些重要基因的遗传转化的研究报道越来越多。

本实验采用超声波辅助农杆菌介导法(SAAT法)转化铁皮石斛原球茎,探讨铁皮石斛遗传转化的影响因素,初步建立一个高效的转化体系。

另外,对于铁皮石斛再生苗的壮苗培养条件进行优化,探讨最适再生苗生长的培养基,主要研究结果如下：(1)将预培养2d直径约1mm的铁皮石斛原球茎接种到筛选培养基中,确定卡那霉素筛选转化与未转化的原球茎的有效选择压。

结果发现：200mg/L卡那霉素能有效抑制原球茎的增殖与分化,并出现死亡现象。

最后将200mg/L作为有效选择压浓度。

(2)由铁皮石斛种子发育成的原球茎为转化受体,优化了超声波辅助农杆菌介导铁皮石斛遗传转化条件,探讨超声时间、侵染时间、共培养时间等因素对转化的影响,得到最佳组合条件,初步建立转化体系。

结果发现：使用90W、40KHZ、初始温度为20℃的超声波清洗器对原球茎超声处理3min、再将原球茎接种到OD600在0.7～0.85范围内的农杆菌侵染液中,侵染15min,然后将其接种到共培养基中暗培养3d。

在体式显微镜下观察GUS瞬时表达情况,发现其表达效率高,蓝色斑点数达到了7.5个/lmmg原球茎,原球茎的损伤程度较小。

(3)根据实验室已提取的外源基因,构建DcNAC2基因表达载体,以卡那霉素抗性基因为标记基因。

并采用冻融法成功转化到农杆菌感受态中。

经验证转化成功。

(4)在Kan霉素筛选压的作用下对转化的原球茎进行筛选,并诱导抗性愈伤的形成。

共转化原球茎基数为900块,目前已得到抗性愈伤12块,剩余的还在筛选当中,将得到的抗性愈伤转接到分化培养基中,诱导再生植株生长。

进一步将通过分子检测得是否为转基因植株。

AtNAC1转录因子的分子建模和铁皮石斛NAC家族基因的克隆及表达分析的开题报告
本文的研究重点是AtNAC1转录因子的分子建模和铁皮石斛NAC家
族基因的克隆及表达分析。

NAC转录因子是植物中一个广泛存在的转录
因子家族，它在植物的生长发育、应对逆境和激素调节等方面发挥重要
作用。

AtNAC1是拟南芥中一个重要的NAC转录因子，已经在生长发育、盐胁迫和干旱逆境等方面的调节中得到广泛的研究和应用。

因此，对其
分子结构的深入研究对于揭示NAC转录因子的功能机制具有重要意义。

铁皮石斛是一种重要的药用植物，具有很高的药用价值。

NAC转录
因子在铁皮石斛中的作用尚不明确，因此对其NAC家族基因的克隆及表
达分析有助于揭示铁皮石斛的生长发育和药用机制。

在本研究中，将使用生物信息学方法对AtNAC1的分子结构进行分
析和建模，并通过构建融合表达载体在真核表达系统中表达，分析其生
物学功能。

同时，将对铁皮石斛中的NAC家族基因进行克隆和序列分析，利用荧光定量PCR技术研究其在铁皮石斛生长发育和应对逆境等方面的
表达模式及调节机制。

本研究的结果有望为揭示NAC转录因子及其在铁皮石斛生长发育和药用机制中的作用提供重要依据。

铁皮石斛拟原球茎的发生过程张启香;付素静;方炎明;陈娜【期刊名称】《浙江农林大学学报》【年(卷),期】2009(026)003【摘要】以铁皮石斛Dendrobium officinale的茎尖为外植体,在特定条件下诱导产生拟原球茎,进一步培养形成幼苗.结果表明:原球茎最优诱导培养基为1/2MS(Murashige and Skoog)+0.5 mg·L-1 6-苄基嘌呤(6-BA)+0.05 mg·L-1 萘乙酸(NAA)+0.1 mg·L-1激动素(KT)+1.0 g·L-1水解乳蛋白(LH).复合添加物的试验表明,土豆汁对拟原球茎(PLBs)的增殖有很好的促进作用.对铁皮石斛拟原球茎的解剖学研究表明:拟原球茎是由位于顶端分生组织下的薄壁细胞脱分化形成的胚性细胞发育而来.外植体接种后20 d左右外植体基部开始膨大,40 d左右出现肉眼可见的乳白色突起,这些突起逐渐增大,成为圆形至卵圆形的乳白色拟原球茎.在条件适宜的拟原球茎增殖培养基上继续培养,拟原球茎边缘的薄壁细胞继续脱分化,进一步发育形成球形的细胞团,可继续形成突起,使拟原球茎不断增殖.【总页数】5页(P444-448)【作者】张启香;付素静;方炎明;陈娜【作者单位】浙江林学院,林业与生物技术学院,浙江,临安,311300;铜仁学院,生化系,贵州,铜仁,554300;南京林业大学,森林资源与环境学院,江苏,南京,210037;南京林业大学,森林资源与环境学院,江苏,南京,210037【正文语种】中文【中图分类】Q943.1;S759.82【相关文献】1.铁皮石斛原球茎与野生铁皮石斛多糖的抗菌及体外抗氧化活性比较 [J], 王玲;唐德强;王佳佳;尚云青;刘铭琳;林烨2.电刺激对铁皮石斛原球茎中石斛碱含量的影响 [J], 何清英;罗志华;林棉杰;陈俊杰;邓秋怡;温斌;陈珺3.硒对铁皮石斛拟原球茎生长及抗氧化系统的影响 [J], 徐国华;常俊;毛善国;罗玉明;丁小余4.铁皮石斛与铁皮石斛原球茎质量比较的研究进展 [J], 韦丽文;辛宁;李培泰;时显芸5.铁皮石斛种子、原球茎和类原球茎体的超低温保存研究 [J], 王君晖;张毅翔;刘峰;黄纯农;葛霁光因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

中国传统兰科药用植物铁皮石斛基因组及其生物学特性研究铁皮石斛为兰科多年生附生草本植物，具有观赏价值和广泛的药用功效，被称为“中华九大仙草”之首。

本文以云南普洱铁皮石斛为材料，结合第二代Illumina HiSeq2000测序技术和第三代PacBio测序技术，得到
contigN50=25.1kb，scaffoldN50=76.4kb的基因组草图，所有的测序量合计覆盖超过了铁皮石斛基因组94%的序列，功能注释了铁皮石斛大约97.56%的蛋白质编码基因。

经分析发现，兰科植物具有完整的花序基因集，而铁皮石斛相对其他单子叶植物，具有独特的花序基因。

同时，在基因家族扩张收缩分析中，我们发现，与真菌共生和抗旱性相关的基因家族发生了明显扩增。

通过分析铁皮石斛药用成分生物合成途径，我们发现与多糖合成相关的SPS 和SUSY基因发生大规模的复制，而铁皮石斛生物碱合成途径可以从已有的研究结果基础上延伸到16-epivellosimine的合成。

本文不仅针对铁皮石斛基因组组装尝试了新的大型复杂基因组组装方法，同时也针对铁皮石斛内生菌、组培快繁技术等进一步研究，为今后研究兰科植物的进化、石斛的药用成分分析、铁皮石斛指纹图谱的建立及其潜在的基因育种奠定了基础。

铁皮石斛功能基因研究概况作者：王胤骁何鹏飞梁志庆来源：《云南中医中药杂志》2021年第08期摘要：铁皮石斛是我国传统名贵药材，近些年，随着分子生物学技术的进步，铁皮石斛在分子方面的研究快速发展，在分子鉴定、遗传多样性、功能基因克隆分析等方面并取得了一定进展。

通过查阅相关文献，综述铁皮石斛功能基因在生长发育调控、次生代谢产物合成和抗环境胁迫三个方面的研究进展，以期为该领域的进一步研究及铁皮石斛的科学、有效、合理利用提供理论依据。

关键词：铁皮石斛;功能基因中图分类号：R282 文献标志码：B 文章编号：1007-2349（2021）08-0088-03铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）系兰科石斛属多年生植物，为我国传统名贵药材，以新鲜或干燥的茎入药，在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，具有滋阴清热、养阴生津、温胃明目、补肾益力等功效。

目前，铁皮石斛已经在种质资源[1]、化学成分及药理作用[2-4]、组织培养[5]、质量控制[6]等研究方面取得了丰硕成果。

近些年，随着分子生物学技术的进步，铁皮石斛在分子方面的研究快速发展，在分子鉴定、遗传多样性、功能基因克隆分析等方面并取得了一定进展。

铁皮石斛功能基因研究主要集中在3个方面：生长发育调控功能基因、次生代谢产物合成功能基因和抗环境胁迫功能基因。

笔者从这三个方面对近年来铁皮石斛功能基因研究进展进行归纳和总结，以期为该领域的进一步研究及铁皮石斛的科学、有效、合理利用提供理论依据。

1 铁皮石斛生长发育调控功能基因研究蛋白质可逆磷酸化是真核生物体调节细胞周期的基础机制，而蛋白激酶（protein kinases，PK）和蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）是蛋白质可逆磷酸化的关键调控酶，在植物体的信号转导途径和生理代谢过程中起重要调节作用。

刘亮亮等[7]通过对铁皮石斛蛋白磷酸酶2A基因（PP2A）进行催化亚基基因克隆、生物信息学、表达模式等研究，发现DoPP2A在根中发挥一定生理作用。

铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗研究蒋波;杨存亮;黄捷;詹源庆;李喜兵【期刊名称】《玉林师范学院学报》【年(卷),期】2005(026)003【摘要】目的:筛选适宜铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗的培养基,提高继代扩繁系数和组培苗的质量.方法:在相同的培养条件下,把相同发育阶段的原球茎接种于含不同激素比例的培养基中生长;把丛生芽接种于蔗糖浓度不同的培养基中生长;把相同高度的幼苗接种于含不同附加物的培养基中生长;对结果所产生的不同生长状况进行综合分析.结果:原球茎的增殖以1/2MS添加BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L或BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L的激素比例为佳;原球茎分化以1/2MS添加BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L或BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L的激素比例为佳;丛生芽的生长中以30%蔗糖浓度的培养基为佳;生根壮苗中最佳的附加物为香蕉.【总页数】4页(P66-69)【作者】蒋波;杨存亮;黄捷;詹源庆;李喜兵【作者单位】玉林师范学院,化学与生物系,广西,玉林,537000;玉林师范学院,化学与生物系,广西,玉林,537000;玉林师范学院,化学与生物系,广西,玉林,537000;玉林师范学院,化学与生物系,广西,玉林,537000;玉林师范学院,化学与生物系,广西,玉林,537000【正文语种】中文【中图分类】Q945【相关文献】1.春石斛和铁皮石斛试管苗壮苗生根条件的优化 [J], 李璐;赖钟雄;翁浩2.不同有机附加物对铁皮石斛原球茎增殖和组培苗生根壮苗的影响 [J], 徐玲;陈自宏;杨晓娜;杨丽华3.黑节铁皮石斛原球茎诱导、再分化以及腋芽萌发和生根的初步研究 [J], 李丹;王馨彩;尹明华4.基于正交实验法的铁皮石斛原球茎分化和生根条件研究 [J], 邵世光;侯北伟;周琪;张潇潇;卢蓓蓓;柏伟娅;丁小余5.悬浮培养的铁皮石斛原球茎在固体培养基上生长和分化的研究 [J], 侯丕勇;郭顺星因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。