发酵法生产L_谷氨酰胺研究进展
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学号:********常州大学毕业设计说明书(2014届)题目400吨/年L-谷氨酰胺生产工艺的设计学生蒋宏伟学院制药与生命科学学院专业班级生工101校内指导教师王利群专业技术职务副教授二○一四年六月年产400吨L-谷氨酰胺生产工艺的设计摘要:L-谷氨酰胺是构成人体蛋白质所必需的20种氨基酸之一。
作为体内游离氨基酸中含量最丰富的条件氨基酸,L-谷氨酰胺主要储存在脑、骨骼肌和血液中,且具有很广泛的生理作用。
比较目前国际国内各种L-谷氨酰胺生产方法和工艺流程之后,我们选择黄色短杆菌ATCC14067SG R突变株发酵生成L-谷氨酰胺,发酵液经絮凝和过滤后,进入活性炭柱脱色,接着进行第一次浓缩结晶,晶体溶解后进行电渗析脱盐,再利用D330树脂进行离子交换,洗脱液输送至浓缩结晶罐中,进行第二次浓缩结晶,通过过滤得到晶体,晶体干燥后得到L-谷氨酰胺成品,总提取率为73%。
本设计在查阅大量资料的基础上,进行了工艺物料计算、能量衡算、设备选型、管道计算、投资估算及经济分析,结果表明总投资为1999.32万元,投资回收期为3.41年。
在此基础上,还绘制了物料流程图、带控制点工艺流程图、车间平面布置图和主要设备条件图。
关键词:L-谷氨酰胺;发酵法;工艺设计;经济分析IThe design of 400T/a L-glutamine production processAbstract: L-glutamine is one of the 20 essential amino acids in constituting human proteins. As the most abundant essential amino acids of free amino acids in human body, L-glutamine is mainly stored in the brain, skeletal muscles, blood and it has a wide range of physiological effects. After comparing the current international and domestic L-glutamine producing methods and processes, a mutant strain of Brebvibacterium (Brebvibacterium ATCC14067SG R) was chosen to fermente L-glutamine.After flocculation and filtration, fermentation broth was transport into active carbon column to decolor, then the eluent was processed by concentration and crystallization for the first time. After the crystals dissolved, electrodialysis desalinization was carried out. the reaction fluid was absorbed by ion exchange resin D330. Then the eluent with L-glutamine was transported to the concentration crystal tank for the second concentration and crystallization. Filter to get crystals, dry, get finished product L-valine.The overall yield is 73%.In this paper, the material balance, the energy balance, equipment selection,pipeline calculation,investment estimate and economic analysis were conducted based on a large number of documents and papers about L-valine production. The financial analysis and evaluation indicated that the total investment is RMB 19.9932 million yuan and the investment returm period is 3.41 years. Based on above calculation and analysis, a material flow chart, a process chart with control points, a floor plan of workshop and a installation of major equipment were drawn.Key words: L-glutamine; Fermentation; Process Design; Economic AnalysisI I1 总论 (1)1.1 设计依据 (1)1.2 设计地区的自然条件 (1)1.2.1 地貌、地质 (1)1.2.2 水位 (1)1.2.3 气候 (1)1.3 生产方法,流程特点,技术的先进性和经济合理性 (2)1.3.1 生产方法 (2)1.3.2 流程特点 (2)1.3.3 技术的先进性和经济合理性 (3)1.4 车间的组成 (4)1.5 生产制度 (4)1.6 车间内水电汽气等公用工程,辅助工程需要量 (4)1.7 经济分析主要结论 (4)2 文献评述 (4)2.1 简史概述 (4)2.2 工业生产方法的选择和论证 (5)2.2.1 化学合成法 (5)2.2.2 酶促合成法 (5)2.2.3 发酵法 (5)2.3 产品的发展前景 (6)3 工艺叙述部分 (6)3.1 设计的生产方法及生产流程的选择与论证 (6)3.1.1 生产菌种的选择与论证 (6)3.1.2 分离纯化工艺的选择与论证 (7)3.2 本设计工艺生产方法简述 (7)3.3 原料,产品,副产品的技术条件 (7)4 原材料,动力(水、电、汽、气等)消耗定额及消耗量 (8)4.1 原材料消耗定额及消耗量表 (8)4.2 动力(水、电、汽、气)消耗定额及消耗量 (9)5 定员 (10)6 环境保护及职业安全卫生 (10)6.1 三废排放和处理方法 (10)6.1.1 废渣处理 (10)6.1.2 废气处理 (11)6.1.3 废水处理 (13)6.2 安全技术 (13)6.3 建筑措施及设备布置 (14)6.4 电器设备 (15)6.5 工艺控制措施 (15)6.6 其他管理措施及通风设施 (15)6.7 职业安全 (16)7 投资估算及经济分析 (16)7.1 总投资估算 (16)7.1.1 工程费用 (16)7.1.2 其他费用 (18)7.1.3 预备费用 (18)7.1.4 专项费用 (18)7.2 产品单位成本估算 (19)7.2.1全年原料成本 (19)7.2.2 工资及附加费 (20)7.2.3 设备折旧费、维修费 (20)7.2.4 车间管理费 (20)7.2.5 企业管理费 (21)7.2.6 工厂成本 (21)7.2.7 销售费用 (21)7.2.8 增值税 (21)7.3 流动资金 (22)7.4 所得税 (22)7.5 全年利润 (23)7.6 投资回收期 (23)7.6.1 静态分析法 (23)7.6.2 动态分析法 (23)8 结论 (24)9 参考文献 (24)10 致谢 (25)附录 (26)1 总论1.1 设计依据根据常州大学毕业设计任务书,本课题是年产400吨L-谷氨酰胺生产工艺的设计,每年生产300天。
一、实验目的本实验旨在通过合成靛蓝染料,研究其染色性能,为牛仔布等纺织品的染色提供新的技术途径。
同时,通过实验验证合成靛蓝染料在染色过程中的环保性能。
二、实验原理靛蓝是一种古老的染料,具有独特的蓝色,广泛应用于纺织印染行业。
传统的靛蓝染料主要来源于植物提取,但植物提取的靛蓝产量低、成本高。
近年来,随着生物技术的快速发展,人们开始探索合成靛蓝染料,以期提高产量、降低成本。
本实验采用生物合成法,以L-谷氨酰胺为原料,通过链霉菌发酵生产靛蓝。
链霉菌具有高效的靛蓝合成能力,其代谢途径包括L-谷氨酰胺、L-色氨酸等前体的缩合反应。
通过优化发酵条件,提高链霉菌的靛蓝合成能力,从而获得高纯度的合成靛蓝染料。
三、实验材料与仪器1. 实验材料:(1)L-谷氨酰胺:分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;(2)链霉菌:由某生物科技公司提供;(3)酵母抽提物、葡萄糖、硫酸铵、碳酸钙、氯化钠:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;(4)靛蓝染料标准品:分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;(5)纯棉牛仔布:市售。
2. 实验仪器:(1)发酵罐:2L、5L、20L,上海仪电科学仪器有限公司;(2)恒温振荡器:DHG-9140A,上海一恒科学仪器有限公司;(3)离心机:TGL-16G,上海安捷伦科技有限公司;(4)紫外-可见分光光度计:UV-2550,日本岛津公司;(5)天平:FA1004N,上海精密科学仪器有限公司。
四、实验方法1. 发酵培养基的制备:(1)酵母抽提物10g、葡萄糖20g、硫酸铵5g、碳酸钙2g、氯化钠1g,加蒸馏水至1000mL;(2)121℃高压灭菌30min。
2. 链霉菌发酵:(1)将活化后的链霉菌接种于发酵培养基中,接种量1%;(2)37℃、200r/min恒温振荡培养24h;(3)将发酵液离心分离,收集菌体;(4)用无菌水洗涤菌体3次;(5)将菌体接种于发酵培养基中,37℃、200r/min恒温振荡发酵48h。
谷氨酸的先进生产工艺谷氨酸是一种重要的氨基酸,在食品添加剂、保健品、药物、化妆品等领域有广泛的应用。
目前,谷氨酸的生产工艺主要有微生物发酵法和化学合成法两种。
微生物发酵法是目前主要的生产方法,下面将重点介绍谷氨酸的先进生产工艺。
微生物发酵法是利用谷氨酸高效产生菌株通过生物代谢反应将低价的有机废弃物转化为谷氨酸。
谷氨酸的先进生产工艺主要包括菌株选育、发酵过程优化和分离纯化技术三个方面。
首先,菌株选育是谷氨酸生产工艺的核心环节。
目前,国内外研究人员已经从多种微生物中筛选出多种高效的谷氨酸产生菌株,如变异株、突变株等。
其中,变态球菌、拟杆菌、乳酸杆菌和乳酸菌是常用的谷氨酸产生菌株。
菌株选育的目标是寻找产量高、菌种稳定、代谢特性好的菌株,并通过遗传工程手段进一步提高菌株的产酸能力和抗性。
其次,发酵过程优化是提高谷氨酸生产效果的关键。
发酵过程优化主要包括培养基优化、发酵条件调控、发酵设备升级等方面。
培养基优化是通过调整培养基组成和添加合适的添加剂来提高菌种的生长速度和产酸能力,如碳源、氮源、有机酸、氨基酸等。
发酵条件调控包括发酵温度、pH值、氧气供给、搅拌速度等,通过合理调节这些因素可以提高菌种的生理代谢活性和谷氨酸的产量。
发酵设备升级是利用现代生物工程技术,开发新的发酵设备和设备控制系统,提高谷氨酸发酵的自动化水平和生产效能。
最后,分离纯化技术是谷氨酸生产工艺中不可或缺的环节。
分离纯化技术主要包括过滤、浓缩、离心、脱色、结晶等过程。
在分离纯化过程中,采用适当的工艺条件和操作方法,可以高效地提取和纯化谷氨酸。
目前,常用的分离纯化技术包括膜分离技术、离子交换及吸附技术、凝胶过滤技术等。
这些技术既可以提高产品的纯度,又可以降低生产成本,提高谷氨酸的生产效能。
综上所述,谷氨酸的先进生产工艺主要包括菌株选育、发酵过程优化和分离纯化技术三个方面。
通过优化这些环节,可以提高谷氨酸的生产效能和产品质量,推动谷氨酸产业的发展。
微生物发酵生产谷氨酰胺转氨酶工艺流程谷氨酰胺转氨酶,这个听起来有点高大上的名字,其实它就是我们身体里的一种重要酶。
它的作用可大了,可以帮助我们把食物里的氨基酸转化成能量。
这个神奇的酶是怎么生产出来的呢?别着急,今天我就给大家揭开这个神秘的面纱,带大家走进微生物发酵生产谷氨酰胺转氨酶的世界。
我们要了解一下什么是微生物发酵。
简单来说,就是让微生物在一定的条件下,把我们想要的东西发酵出来。
这个过程就像是我们自己在家里做酸奶一样,把牛奶放在一个温暖的地方,让乳酸菌发酵,最后就能得到美味的酸奶。
而微生物发酵生产谷氨酰胺转氨酶的过程也是类似的,只不过我们要用的是特殊的微生物和特殊的培养基。
我们就要开始制作这个神奇的培养基了。
我们需要准备一些原料,比如玉米淀粉、酵母粉、蛋白胨等等。
这些原料都是为了让微生物在里面生长繁殖,从而产生我们需要的谷氨酰胺转氨酶。
我们要把这些原料混合在一起,加上适量的水,搅拌均匀,就得到了我们的培养基。
现在,我们的培养基已经准备接下来就是要把我们需要的微生物放进去了。
这个时候,我们要用到一个叫做“液体平板”的东西。
液体平板是一种可以快速繁殖微生物的工具,我们只需要在上面滴上一滴培养基,然后放在一个温暖的地方,就可以让微生物在上面快速繁殖了。
我们要根据我们的需求选择不同种类的微生物,这样才能生产出我们需要的谷氨酰胺转氨酶。
当微生物在液体平板上繁殖到一定数量的时候,我们就可以开始进行发酵了。
这个时候,我们要把含有谷氨酰胺转氨酶的培养基倒进液体平板里,让微生物在上面进行发酵。
这个过程就像是我们在厨房里做饭一样,把食材放在锅里加热,让它们发生化学反应。
只不过,这次我们是让微生物在培养基里进行化学反应,从而生产出我们需要的谷氨酰胺转氨酶。
发酵的过程通常需要一段时间,具体时间取决于我们要生产的谷氨酰胺转氨酶的数量。
在这个过程中,我们要密切观察微生物的生长情况,确保它们能够顺利地进行发酵。
如果发现微生物的生长速度不够快,或者出现了其他问题,我们就需要及时调整培养条件,让它们能够更好地生长繁殖。
第47卷第2期2018年6月发酵科技通讯Bulletin of Ferm entation Science and TechnologyV ol. 47 N o. 2Jun.2018 L-谷氨酰胺稳定性研究唐艳1,吴涛#,王晓玉1(1.梅花生物科技集团股份有限公司,河北廊坊065001 '.廊坊梅花生物技术开发有限公司,河北廊坊065001)摘要:L-谷氨酰胺产品在室温条件存储易出现变黄、吸潮现象.因此探究其在高温、高湿和强光照条件下的稳定性具有十分重要意义.选定高温、高湿和强光照等单因素条件,以及两个特定的加速实验条件,对L-谷氨酰胺产品的稳定性进行了系统性研究.结果表明:L-谷氨酰胺产品在强光照、密闭包装下可以长期稳定保存,但在高温、高湿条件下不稳定,产品的白度、透光以及干燥失重均发生变化.因此,建议L-谷氨酰胺产品应密闭包装,在生产、运输和储存过程中保持干燥,以确保产品质量的稳定性.关键词:L-谷氨酰胺;稳定性;加速试验;储存;吸潮中图分类号:T Q92 文献标志码:A文章编号=1674-2214(2018)02-0097-03Study on stability of L-glutamineT A N G Y an1,W U Tao2,W A N G X ia〇y u1(1. Meihua Holdings Group, Langfang 065001, China;2. Meihua Biotech (Langfang) Co. $Ltd. $Abstract%L-glu tam in e stored at room tem perature prone to yellow in g and in filtra tin g.T h e re fo re,it is of great significance to explore its s ta b ility under high te m perature,high h u m id ity and stronglig h t conditions.In th is paper,the s ta b ility o f L-g lutam ine was system atically investigated under high te m p era ture,high h u m id ity,strong lig h t and tw o specific accelerated experim ental conditions.The results showed th a t L-g lu tam ine could be stored stably fo r a long tim e under strong su nligh t and closed packaging conditions.H o w e v e r,the w hiteness,lig h t transm ission and weightlessness of L-g lu ta m in e were 6hanged under high tem perature and high h u m id ity conditions.T h e re fo re,it is suggested th a t L-g lu tam ine products should be sealed in containersand keeping d ry during p ro d u ctio n,tra n sp o rta tio n and storage,to ensure the s ta b ility o f the productKeywords%L-g lu ta m in e;s ta b ility;accelerated test;storage;absorb m oistureL-谷氨酰胺是人体中含量最丰富的非必需氨基 酸,是合成氨基酸、蛋白质、核酸和其他生物分子的前体物质[1],可通过人体自身的谷氨酰胺合成酶合成,也可由谷氨酸、缬氨酸和异亮氨酸转化合成. L-谷氨酰胺具有提高免疫力2、增长肌肉、增强脑机 能、维持肠胃结构3和抗氧化等功能4,被广泛应用 于食品、保健品、医药[5]、饲料6等领域.笔者旨在考 察高温、高湿、强光照和加速实验对谷氨酰胺产品稳定性的影响,为谷氨酰胺产品的生产、包装、贮存和 产品运输条件提供依据.1仪器与方法1.1仪器LabonceAOOCGS型药物稳定性实验箱(北京 兰贝石恒温技术有限公司),722E可见分光光度计收稿日期:2018-02-27基金项目:河北省氨基酸工程技术研究中心创新平台建设资助项目(131000021)作者筒介:唐艳(1987—),女,内蒙古通辽人,助理工程师,研究方向为氨基酸分析检测,E-mail:1041647978®qq. com•98 •发酵科技通讯第47卷(上海洪纪仪器设备有限公司"电热鼓风干燥箱(北 京市永光明医疗仪器厂"白度仪(上海昕瑞仪器仪表有限公司"92方法实验的方法主要参照《中国药典》(2015 版)[7]—9001原料药物与制剂稳定性实验指导原则.主要考察在温度、湿度和光线的影响下,样品随 时间变化规律,为产品的生产、包装、存储和运输提供科学依据.1.2.1高温、高湿、强光照的单因素条件试验方法取L-谷氨酰胺产品,置于开口的玻璃器皿中,摊成'10m m的薄层,放置在稳定性实验箱中,60 I下放置10 7于第5天及第10天取样,将结果 与第0天数据对比分析.同时用自封袋包装,进行同 样实验,并作对照试验.1.2.2 加速条件试验方法取3批L-谷氨酰胺产品,每批样品分3份,每份约 100 g,将样品置于自封袋中,在温度40 I,相对湿度 (75±5)%条件下放置6个月,在试验期间的第1个月、第3个月及第6个月分别取样一次,进行检测,将结果 与第0月数据对比分析.1.2.3 长期室温密闭条件试验方法取3批L-谷氨酰胺产品,每批样品分3份,每 份约100 g,将样品置于双层自封袋中,并用公司包 装袋压缩封口密封包装,在试验期间第1年、第2年 及第4年分别取样一次,进行检测,将结果与第0年 数据对比分析.2结果分析2.1局温影响L-谷氨酰胺产品在温度60 I、湿度20%、无 光照条件下放置10 7检测结果与第0天进行对比分析,除了白度下降,其他指标无明显变化,开 口放置检测结果见表1.自封袋包装放置1个月,表1高温试验结果Table 1 The results of high temperature test批号放置时间/d透光/%干燥失重/%白度RSD/%098.=20.=1094=00=25 01批598.09301098=00=0992=20=30098=50=1096=00=26 02批59809501098=20=0994=70=26098=900698=90=31 03批598=80069801098400797=00=31检测结果见表2.高温条件会改变谷氨酰胺成分及性质,产品颜色加深,高温条件不适合L-谷氨酰胺 产存=表2高温验结果Table 2 The results of high temperature test 批放置时间/月白度01 批094=0192=102 批096=0194=203 批098=9196=52.2局湿影响L-谷氨酰胺产品在相对湿度为(75 k5)%、温 度20 I、无光照的条件下放置10 7检测结果与第0天对比分析,除了干燥失重增加,其他指标无明显变化,开口放置检测结果见表3.自封袋包装 放置3个月,检测结果见表4.在高湿条件下,湿气 会通过自封袋的封口处慢慢进人袋内被样品吸收,使样品吸潮,高湿条件不适合L-谷氨酰胺产品 存=表3高湿试验结果Table 3The results of high humidity test批号放置时间/7 透光/%干燥失重/%白度RSD/%098. 20. 1094=00=28 01 批598=20=1593=901098=10=2093=90=29098=50=1096=00=18 02 批598=30=1396=001098=20=1895=80=22098=90=0698=90=20 03 批598=10=0898=501098=60=1498=80=23表4 高验结果Table 4The results of high humidity test批放置时间/月干燥失重/%01 批00=1030=4502 批00=1030=4203 批00=0630=382.3强光照影响L-谷氨酰胺产品在光照条件(4 500±500) L x、温度20 I、湿度40%条件下放置10 7检测结果与 第0天对比分析,各项指标无明显变化.强光照射对 L-谷氨酰胺产品储存无影响,见表5.第#期唐艳,等:L-谷氨酰胺稳定性研究•99 •表J强光照试验结果Table 5 The results of strong light test批放置时间/d透光/%干燥失重/%白度098. 20. 1094.001批598.20. 1093.81098. 10.0993.8098.50. 1096.002 批598.40. 1095.91098.20. 1095.8098.90.0698.903 批598.80. 0798.61098.60. 0798.62.4对照试验L-谷氨酰胺产品在室温20 1、室湿!0%、无光照条件下放置l〇d,检测结果与第0天对比分析,各项指标无明显变化.室温、室湿条件对L-谷氨酰胺产品储存无影响,见表6.表K对照试验结果Table K The results of controlled trail批放置时间/d透光/%干燥失重/%白度098. 20. 1094.0 01批598.20. 1093.91098.20.0993.9098.50. 1096.002 批598.50. 1095.91098.40. 1095.9098.90.0698.903 批598.80.0698.81098.80. 0798.82.5 加速实验2.5.1 加速条件40 1,相对湿度75%L-谷氨酰胺产品在温度40 1,相对湿度(75 k5) %条件下放置6个月,测定结果与第0月进行对比分析,加速条件下产品的透光降低、干燥失重升高、产 品吸潮、白度降低.L-谷氨酰胺产品在此加速条件下 不稳定,见表7.表7加速试验结果Table 1 The results of accelerated test批号放置时间/月01批A602批;603批;6透光/%干燥失重/% 白度98. 2 0. 10 94. 097.4 0.14 93.997.3 0.46 91 59".0 0.5 91.098.5 0.10 96.098.0 0.13 94.89".3 0.46 93.096.8 0.50 92.598.9 0.06 98.998.0 0.10 94.69".2 0.20 93.996.2 0.40 93.5RSD/%0300250280290300.2"0260310.2"0280300312. 5.2 加速条件温度30 1,相对湿度65%L-谷氨酰胺产品在温度30 1,相对湿度(65 k 5) %条件下放置6个月,测定结果与第0月进行对 比分析,加速条件下产品的透光降低、干燥失重升高、产品吸潮、白度降低.L-谷氨酰胺产品在此加速下不 ,见表8.表8加速试验结果Table 8 The results of accelerated test批置间/ 月透光/%干燥失重/%白度RSD/%098. 20. 1094.003101批19".60. 1493.502939".20.3092.603069".00.4591 8029098.50. 1096.002802 批19".90. 1395.003039".30.3993.20.2"696.20.4892."026098.90.0698.902803 批198.50. 109".503139".90. 3196.203069".30.4694. 10292.6长期室温密闭试验2013年生产的L-谷氨酰胺样品密闭包装,室温 置 201" 行 测,测 与 0析,长期室温密闭放置下产品的干燥失重、透光、白度均无明显变化.L-谷氨酰胺产品密闭包装在室温条件下可长期储存,见表9.表W长期放置试验结果Table 9 The results of long-term placement test批放置时间/;透光/%干燥失重/%白度RSD/%098. 50.0695.802901批198.30. 0795.6030298.30.0895.6028498.20.0995.5026098.80.0898.202402 批198.80.0898. 1025298."0.0898. 1028498.50.0898.0026098.60.069".80.2"03 批198.50.069".6029298.50. 0797. 7030498.30. 079".6029 A结论L-谷氨酰胺产品在密闭包装、室温长期存放条件下,产品指标无变化,处于稳定状态.光照对产品无影响,但在高温、高湿条件下不稳定,高温、高湿对 产品的白度、透光和干燥失重影响较大.因此,L-谷 氨酰胺产品应密闭包装,在生产、运输和储存过程中 应保持干燥.(下转第104页)•104•发酵科技通讯第47卷性最好,最优组合为A2B3C i,即高酰基结冷胶质量分数为0.03%,C M C质量分数为0.12%,大豆多糖 质量分数为0. 02%.影响产品质量的因素A>C> B,即高酰基结冷胶质量分数&大豆多糖质量分数>C M C质量分数.对最优组合进行验证试验,得到 沉淀率的平均值为3. 75%,优于其他组合.由于高酰基结冷胶与大豆多糖和C M C之间具 有协同作用,在酸性条件下形成稳定的分散体系,并 能保护胶体,补偿蛋白质阴离子电荷,吸附在酪蛋白 表面,从而起到稳定酪蛋白的作用,同时防止蛋白质 因聚集而导致沉淀、脂肪上浮和分层[1213].试验结果 显示:高酰基结冷胶质量分数为0. 03%,C M C质量 分数为0. 12%,大豆多糖质量分数为0. 02%,此时 乳酸菌饮料稳定效果最好,且明显降低了使用单一稳定剂的添加量,从而能有效地降低生产成本.A结论当常温型乳酸菌饮料中白砂糖质量分数为6%,发酵酸奶基料质量分数为7%,单双甘油脂肪酸酯质量分数为0.02%时,乳酸菌饮料的感官品质 最佳.各稳定剂对乳酸菌饮料的稳定性都有较大影响,其中高酰基结冷胶对产品稳定性影响最大,当高 酰基结冷胶质量分数为0. 03%,C M C质量分数为 0. 12%,大豆多糖质量分数为0. 02%时,常温型乳 酸菌 料的(上接第99页)参考文献:)1]彭莉.谷氨酰胺代谢与运动[J].中国体育科技,2001,37(4"12-14.[]王书平,刘俊华.谷氨酰胺生理功能与应用研究进展安徽农业科学,2009,37(22) 10376-10377.[]路静,李文立,姜建阳,等.谷氨酰胺对肉鸡小肠组织结构和吸收能力影响[?].动物营养学报,2012,24(2) :291-300.[4] LINDINGER M I,ANDERSON S C .Seventy day safety assessment of an. orally ingested,1 -glutamine-containing oat and 参考文献:[I]张旗,范义文,左军杰,等.高酰基结冷胶在食品饮料中的应用研究[J].广州化工,2014(20) :51-52.[]范婷婷,岳征,李树标,等.复配胶体对面包烘焙质量的影响[J].发酵科技通讯,2017,46(3) 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谷氨酸胺经一般由γ-酰肼而得,通常采用在二硫化碳存在下使L-谷氨酸- γ-甲酯酰胺化而得。
即以-谷氨酸为原料,溶于甲醇和硫酸,氨水中和后加入二硫化碳,再用氨水中和,除氨后加乙酸,蒸去含硫化合物,再加入甲醇,过滤、干燥得产品。
当然,除以上办法外,大家还可则采用发酵法和合成法。
合成法即由L-谷氨酸-5-甲酯([1499-55-4]) 经缩合、加成、成盐、水解而得。
谷氨酸胺在浓硫酸存在下与甲醇酯化,所得的酯化液滴加入甲醇和二硫化碳的混合液中,一边滴加,一-边在冷却下通氨。
酯化液滴加完后,继续通氨,然后加入三乙胺,在30"C 密闭放置40h。
经减压浓缩赶氨后,得γ-甲酯-L-谷氨酸-N-氨荒酸二铵盐浓缩液。
将其加热至40-45"C,加入乙酸。
搅拌30min后,减压除去二硫化碳,此时析了大量结晶。
然后加入等体积甲醇,于0C放置12h,过滤,得谷氨酰胺粗品。
经活性炭脱色、重结晶得成品;而发酵法则是将葡萄糖或乙酸、乙醇作为培养基碳源,用黄色短杆菌菌种发酵,以葡萄糖计产率为39g/L,收率为39%。
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谷氨酸发酵生产菌的研究与开发 L一谷氨酸微生物工业化发酵生产已有50余年历史,回顾国内各味精厂曾使用过的菌种,主要是1.天津短杆菌;2.钝齿棒杆菌;3.北京棒杆菌及它们的突变株。目前厂家用葡萄糖发酵所使用的菌种主要为天津短杆菌T613的突变株,有FM820;FM84—415;FM一1至0 FM一20;S9114等,上述生产菌种,主要是通过诱变为主的微生物育种,它的产酸能力伴随着谷氨酸发酵生产发展获得了很大的提高。但如果在现有产酸能力情况下,继续采用传统(经典)微生物育种技术(如诱变、细胞融合等手段)选育菌种,以期达到大幅度提高产酸率和糖酸转化率已变得相当困难。因此,采用现代基因工程手段改造菌种,从而提高产酸率和糖酸转化率不失为目前最有效的方法。但上述菌种在基础研究方面的工作并不十分深入,甚至是短杆菌还是棒杆菌在概念上也不十分清晰,这无疑给用基因工程手段改造菌种带来一定的困 惑。 L一谷氨酸作为生产量最大的氨基酸之一,通过改造菌种以提高产酸率和糖酸转化率具有很大的经济意义。国内在谷氨酸菌种基因改造方面的研究工作到目前为止基本上还属空白,国外在这方面的研究工作已取得了一定的科研成果,但报导不多,且菌种、生产工艺以及原料和国内技术有所差别。根据国内现有生产菌种的特性,利用基因工程手段改造生产菌种,从而提高产酸率和糖酸转化率,虽还需要一段时间的深入研究,但这种趋势和研究结果显示,届以时日,谷氨酸的产酸率和糖酸转化率定会有较大的突破。目前,在棒杆菌中的表达 质粒和针对谷氨酸合成代谢途径中关键酶表达基因方面已做了一定的工作,如果进一步利用基因工程手段在现有谷氨酸生产菌种方面做更深入的研究就可达到提高菌种的产酸率和糖酸转化率目的,并且不必对目前的生产工艺和配方做过多的修改。 1 棒杆菌表达质粒的构建 目前国内的生产菌种产酸水平已很高。如果撇开目前使用的生产菌种,而重新构建在基因工程研究工作方面比较成熟的菌种,如大肠杆菌上进行产谷氨酸基因重组,那构建的新菌种则很难超越在谷氨酸代谢合成机理上已很有效的棒杆菌的产酸水平,生产工艺也要变化,所以没有实际应用价值。因此,选择在菌种的基础上进行基因重组改造工作,以达到增强效果,使产酸率和糖酸转化率水平更高。在棒杆菌上进行基因重组,需要有能够表达外源基因的载体质粒,但到目前为止国内外都没有找到棒杆菌本身的内源性质粒可以作为载体质粒,因此,构建一个大肠杆菌质粒经过与棒杆菌内源的一些基因整合,并适合在棒杆菌内表达的穿梭质粒成为研发的关键。L一谷氨酸是由三羧酸循环的中间代谢产物仅一酮戊二酸转化而来的,如果增加三羧酸循环的流量,就增加了仅一酮戊二酸的流量,也就可以增加谷氨酸的产量。据国外在野生型谷氨酸棒杆菌中通过对丙酮酸羧化酶基因重组菌的研究报道,与野生型谷氨酸棒杆菌相比,基因重组菌可以提高谷氨酸产量7倍。 在谷氨酸棒杆菌中,作为碳源的葡萄糖分解代谢提供菌生长所需要的能量及菌体和合成产物的碳成分。一般葡萄糖代谢经果糖一6磷 酸分解,再经丙酮酸和乙酰CoA进入三羧酸循环进行代谢,并经仅一酮戊二酸产生谷氨酸。理论上(不考虑菌体生长及呼吸消耗)一分子六碳的葡萄糖最终产生一分子五碳的谷氨酸,理论糖酸转化率为81.7%,但实际生产过程中由于还有菌体生长和呼吸能量需求,糖酸转化率为60%左右。在这一谷氨酸合成代谢途径中,由丙酮酸转化为乙酰CoA过程中释放一份CO ,这使得葡萄糖的利用率降低,葡萄糖—— 谷氨酸转化率也降低。磷酸解酮酶(PKT)能使得这一份C0 不被释放而浪费,它通过催化葡萄糖分解代谢中间产物果糖一6磷酸为乙酰磷酸和赤藓糖一4磷酸, 以及催化木酮糖一5磷酸(木酮糖一5磷酸是棒杆菌本身存在的5碳糖代谢路径合成转化的)为甘油醛一3磷酸和乙酰磷酸,两步催化反应产生的乙酰磷酸直接转化为乙酰CoA,再由乙酰CoA进入j三羧酸循环。通过这一代谢途径可以绕过由丙酮酸转化为乙酰CoA的途径,避免了丙酮酸转化为乙酰CoA时释放CO:而产生的碳损失,也即葡萄糖的损失。通过这一PKT催化的代谢途径,理论上5个葡萄糖分子能产生6个谷氨酸分子,理论转化率从原来的81.7%提高到98%。国外有报道,利用基因工程技术将PKT的表达基因重组进棒杆 菌中,能将谷氨酸生产时的糖酸转化率从60%到69%PKT(磷酸解酮酶)在谷氨酸棒杆菌中是不存在的,从动物双岐杆菌中获得了PKT的结构基因pk,并将它克隆到穿梭质粒p.1L23中,通过接合转化在谷氨酸棒杆菌中获得转化子有关的基因有耐高温相关基因、耐低溶氧相关基因等,重组含这些基因的菌种可以大大改善生产工艺条件,降低生产 成本。 2 谷氨酸菌种基因工程技术研究存在问题的原因 2.1 传统产谷氨酸棒杆菌的高产量阻碍了谷氮酸菌种基因工程技术的研究谷氨酸由于处于比较接近于微生物基础代谢的氨基酸,在棒杆菌中产量较高,通过微生物诱变育种方法相对于其它氨基酸来说可以较容易获得产量高的生产菌种,因而之前较少考虑采用基因工程方法来提高菌种的产酸水平,也因此在应用基因重组技术方面起步比其它氨基酸要晚。 2.2 谷氨酸代谢途径的复杂性 正是由于谷氨酸是比较接近于微生物基础代谢的氨基酸,其合成分解代谢途径比较发达,影响其合成和分解代谢的因素比较多,在它的合成代谢途径中许多因素如酶和基因或者是多功能的或者是作用还不明确,这对于利用基因工程技术改变谷氨酸代谢途径以提高菌种的产量造成很大的难度。到目前为止,许多影响因素还在继续进行基础性的研究中,还不能直接应用到菌种的改造中去。 2-3 棒杆菌基因工程技术不完善性 早期在原核微生物中对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌以及真核微生物中对酵母菌的遗传背景比较清楚,因而对这些菌的基因工程研究工作比较早而对棒杆菌属中一些种的遗传背景是近年来才开始研究,对棒杆菌的基因工程研究工作相对落后,到目前为止技术还不是非常成熟。以载体质粒为例, 目前在棒杆菌中应用的质粒都不是棒杆菌身的内源性质粒,都是人工构建的带有部分棒杆菌遗传特征的外源质 粒,因此在质粒启动复制、转录调控和产物表达方面效率不高。而在产谷氨酸菌种方面进行基因工程研究工作时,离开棒杆菌重新构建其它新的菌种很难有大的突破。 3 谷氨发酵菌种基因工程技术研究的努力方问 目前已有几个与谷氨酸代谢有关的关键酶和与调控有关的蛋白的作用是明确的,每一个相对应的基因克隆和剔除对提高谷氨酸的产量或糖酸转化率都会有所帮助,但要比较明显的提高,需要多个基因的串联表达,共同作用。除了与谷氨酸代谢直接有关的基凶工作外,在与基因的表达调控有关的间接的基因重组工作方面也需要进行,只有多因素、多方面基因重组研究工作取得进展和成功应用,谷氨酸的产量和糖酸转化率才会取得重大突破。产谷氨酸棒杆菌的谷氨酸代谢途径中还有许多影响因素没有搞清楚,需要进一步研究确定,这也使得构建谷氨酸基因工程菌的进展比其它氨基酸落后。国外在这方面的研究力度比较大,在国内这方面基本上还是空白。这方面的工作还需持续深入进行。 4 谷氨酸发酵菌种基因工程技术的应用前景 从目前研究进展来看,通过基因工程技术手段寻求提高谷氨酸产酸水平是一条比较有效的途径,可以肯定的是,基因工程技术在提高谷氨酸发酵水平方面前景良好。出师表
一、实验原理:谷氨酸,学名: 2-氨基-5-羧基戊酸,为酸性氨基酸,是构成蛋白质的20 种常见α-氨基酸之一。
谷氨酸又名“麸酸” 或写作“夫酸”,是制造味精的原料。
D-谷氨酸参与多种细菌细胞壁和某些细菌杆菌肽的组成。
发酵制造L-谷氨酸是以糖质为原料经微生物发酵,发酵液中存在菌体、蛋白质、残糖、色素、其它氨基酸、有机酸等杂质。
目前国内提取谷氨酸的主要方法:1.等电点法; 2.离子交换法;3.金属盐法;4.盐酸水解等电法;5.离子交换膜电渗析法。
国外大规模提取谷氨酸的方法:日本采用浓缩等电点工艺;美国采用旋转真空膜过滤。
谷氨酸等电点pI=3.22,在等电点时谷氨酸的溶解度最小,且谷氨酸的溶解度随温度降低而减小,所以调节pH以及降低温度可以令溶液中的谷氨酸析出沉淀即为等电点法提取谷氨酸。
氨基酸为两性电解质,等电点较低的谷氨酸在pH小于pI 3.2时,主要以GA+型式存在,故可用强酸性阳离子交换树脂提取,当发酵液流过交换柱时,发酵液中各成分依亲和力的不同进行交换,吸附GA的树脂再用洗脱液(5% NaOH)洗脱,收集富含GA的流分(高流液)。
二、材料与器材:(1)实验材料:谷氨酸发酵液(2)实验药品:NaOH、HCl、酸性离子交换树脂、壳聚糖醋酸溶液、硅藻土(3)实验仪器:圆底烧瓶、离心机、离心管、天平、玻璃棒、磁力搅拌器、一次性塑料滴管、pH计、铁架台配有十字夹、色谱柱、SBA、3mL离心管(用于柱层析接收样品)、烧杯(500mL1个;250mL1个;50mL1个)、量筒2个(10mL 和100mL,)。
三、实验步骤:(1)发酵液的预处理壳聚糖醋酸溶液:先配置2%体积比的醋酸溶液;然后加入壳聚糖配置成1%的壳聚糖醋酸溶液。
取100mL发酵液,再加入含量为1%的壳聚糖醋酸溶液,此时溶液pH值在5.52,谷氨酸含量为22mg/dl,加入量为发酵液体积的1.4%,轻轻搅拌加入1g硅藻土,静置2h。
(2)发酵液的固液分离取上清测谷氨酸含量,进行固液分离,采用离心(6000rpm 20min)方式进行固液分离,再次取上清测谷氨酸含量为30mg/dL。
第十五章丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵第一节丙氨酸发酵丙氨酸(Alanine,A1a),亦称α-氨基丙酸(α-aminopropionic acid),具有甜味,常用作调味料。
霉菌、酵母、细菌、放线菌等微生物都能够由糖类和无机氮源、有机氮源发酵生产L-丙氨酸。
这就是所谓的直接发酵法。
后来又开发了酶法及固定化法等,原料则使用延胡索酸或L-天冬氨酸。
发酵法生产L-丙氨酸,主要是以降解葡萄糖等碳源生成的丙酮酸为底物,经过氨基转移反应或还原氨基化反应完成的。
酶法是以L-天冬氨酸为底物,经过L-天冬氨酸-β-脱羧酶的反应,生成L-丙氨酸。
1.氨基转移反应氨基转移反应,很早就已为人所知,该反应广泛分布在植物、动物、微生物的代谢过程之中。
北井等的研究表明,丙氨酸产生菌胶状棒杆菌(Corynebacterium gelatinosum)No.7183,是通过丙酮酸与L-谷氨酸之间的转氨作用生成丙氨酸的。
最初由氨基移转反应生成的丙氨酸是L-丙氨酸,但是经丙氨酸消旋酶的作用,转变成D-丙氨酸,因此该菌株生成的最终产物是DL-丙氨酸。
2.还原氨基化反应Wiame和Goldmann分别报导了枯草杆菌、肺结核小杆菌(Myeobacterium tuberculosis)有还原氨基化反应。
鲛岛等在假单胞菌No.483的无细胞抽出液中,检出了丙氨酸脱氢酶活性,该酶以NAD为辅酶,最适pH为9.8。
但是还原氨基化反应的氢并不是由乳酸脱氢酶反应提供,而是由丙糖磷酸脱氢酶反应供给。
该菌株生产的丙氨酸是L-丙氨酸。
3.天冬氨酸-β-脱羧酶反应由于大多数采用直接发酵法生产的丙氨酸是DL-型,而L-天冬氨酸可通过酶法由反丁烯二酸廉价生产,因此,可采用天冬氨酸为原料,利用天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸-β-羧基的裂解来生产L-丙氨酸。
Chibata等发现德阿昆哈假单孢菌(Pseudomonas dacunhae)具有很高的天冬氨酸-β-脱羧酶活性。
谷氨酸棒状杆菌高效发酵谷氨酸的关键分子机理研究进展杨阳;张苗苗;高越;郭晓鹏;李文建;冷非凡;陆栋【摘要】谷氨酸是世界上产量最大的氨基酸,在食品、医药、工农业等领域具有广泛的用途.谷氨酸棒状杆菌是工业生产谷氨酸的主要菌株,从发现谷氨酸棒状杆菌以来,国内外在谷氨酸过量产生机理方面的研究已取得了一定的科研成果.本文就发酵过程中基因转录水平、关键酶酶活、细胞膜与运输蛋白的结构3个层面机理的研究进展做一综述.最后对谷氨酸过量产生的机理进行分析,将来需从生理作用及调控因子等方面研究,进一步完善谷氨酸过量产生机理,以期对提高谷氨酸产量以及开发微生物合成其他生物产品提供参考和方向.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2019(040)005【总页数】6页(P311-315,321)【关键词】谷氨酸棒状杆菌;谷氨酸发酵;分子机理【作者】杨阳;张苗苗;高越;郭晓鹏;李文建;冷非凡;陆栋【作者单位】兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730050;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;甘肃省微生物资源开发利用重点实验室,甘肃兰州730070;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;甘肃省微生物资源开发利用重点实验室,甘肃兰州730070;兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730050;中国科学院近代物理研究所,甘肃兰州730000;甘肃省微生物资源开发利用重点实验室,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】TS201.1谷氨酸是食物蛋白质的重要组成,在营养代谢、能量供应、免疫响应、氧化应激及信号通路调节等过程中发挥重要作用[1]。
因此,谷氨酸作为一种重要氨基酸被广泛应用于食品、饲料、医药、化妆品等行业。
谷氨酸是由α-酮戊二酸与游离氨在谷氨酸脱氢酶的催化下发生还原氨基化而形成。