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2.微生物限度检查
参照中国药典2005年版一部要求，对微生物限度检查作验证试验如下：2．1微生物限度检查法验证实验
2.1.1.验证用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003、枯草杆菌CMCC （B）63 501、大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）98 001、黑曲霉CMCC（F）98 003
2.1.2方法：中国药典2005年版附录一部XIII C 微生物限度检查方法验证试验。
2.1.3操作方法：
（1）菌液制备：
a. 取经37℃培养24h金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
b. 取经25℃培养24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-5（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
c. 取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，用5ml生理盐水洗下霉菌孢子，吸取菌液，用标准比浊管比浊，然后取1ml+9ml生理盐水10倍稀释至10-4（细菌数约为50~100cfu/ml）做活菌计数备用。
（2）供试液制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，分别人工污染上述5种代表实验菌株。
（3）回收率测定
a. 实验组：取1:10供试液1ml和1ml实验菌液同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时，观察计数。
b. 活菌组：照上述方法测定每1菌株的实验菌数。
c. 供试液对照：测定供试品本底菌数。
d. 稀释剂对照组，取稀释液同法操作，测定，应无菌生长。
4.结果：菌落计数结果，回收率实验结果，见表2、表3：
表2 菌落计数（cfu/ml）
从表3可知，玉屏风泡腾颗粒样品处理后，按常规法进行微生物限度检查，供试品对5种菌株的回收率试验均高于70%可采用此法检验。
测定方法：取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液，取此液1ml按常规平皿计算法测定即得。
经测定，三批样品微生物检查结果见表4：
表 4 微生物限度检查结果
批号050215 050216 050217
10-110-110-1稀释倍数 3 2 2
细菌总数（<1000个/g ）
2 2 2
平均2.5 平均2.0 平均2.0 报告25个/g 报告20个/g 报告20个/g
0 1 1
霉菌、酵母菌总数（<100个/g）
1 1 1
平均0.5 平均1.0 平均1.0 报告5个/g 报告10个/g 报告10个/g
大肠埃希菌未检出未检出未检出活螨未检出未检出未检出结论：三批样品均符合规定。
头孢呋辛酯片微生物限度检查方法验证资料
一、验证依据：《中国药典》2005年版二部附录ⅪJ“微生物限度检查法”
二、品名、规格、批号、厂牌：
品名：头孢呋辛酯片
规格：0.125g
批号：060417、060418、060419
厂牌：江苏正大清江制药有限公司
三、培养基名称、批号、来源：所用培养基的名称、批号、来源见表1。
表1 培养基的名称、批号、来源
培养基名称批号来源
营养琼脂培养基050524 北京三药科技开发有限公司
营养肉汤培养基030225 北京三药科技开发有限公司玫瑰红钠琼脂培养基051009 北京三药科技开发有限公司
曙红亚甲蓝琼脂培养基050203 北京三药科技开发有限公司胆钠乳糖培养基050402 北京三药科技开发有限公司
改良马丁培养基050411 北京三药科技开发有限公司改良马丁琼脂培养基050401 北京三药科技开发有限公司
四、菌种：所用菌株的名称、批号、来源见表2
表2 菌株的名称、批号、来源
菌株名称菌种传代次数来源大肠埃希菌Escherichia coli CMCC(B)44102 第2代中国药品生物制品检定所金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus CMCC(B)26003 第3代中国药品生物制品检定所枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CMCC(B)63501 第4代中国药品生物制品检定所白色念珠菌Candiada albicans CMCC(F)98001 第2代中国药品生物制品检定所黑曲霉Aspergillus niger CMCC(F)98003 第3代中国药品生物制品检定所
五、验证内容：
1.细菌数、霉菌及酵母菌计数方法验证：鉴于本品为头孢类抗生素，其主要作
用是抗细菌，故对细菌计数方法及控制菌检查方法拟采用低速离心-薄膜过滤联合应用的方法进行验证，霉菌及酵母菌的计数方法采用常规方法进行验证。1）细菌数计数方法验证：
（1）菌液的制备：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物1白金耳接种至营养肉汤培养基中，培养18～24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml中含50～100cfu的菌悬液。
（2）供试液的制备：称取供试品10g，研细，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，摇匀，取10ml低速（500转/分）离心5分钟，取上清液并补足10ml，摇匀，即为1：10供试液。
（3）验证方法：
试验组：取低速离心后制备的供试液1ml，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用0.45μm微孔滤膜过滤，再用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100ml，最后一次冲洗液中加入50～100cfu的试验菌，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基平板上，于30～35℃培养48小时，测其菌数。
菌液组：按照平皿计数方法测定所加的试验菌数。
供试品对照组：取低速离心后制备的供试液1ml，加到pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，薄膜过滤，用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基平板上，于30～35℃培养48小时，测其菌数。
稀释剂对照组：取pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10ml，置离心管中，加入500～1000cfu的试验菌，以500转/分，离心5分钟，取1ml，加到pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，薄膜过滤，用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100ml，取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基平板上，于30～35℃培养48小时，测其菌数。
上述验证试验平行独立试验三次。
回收率的测定：根据上述试验测得的菌数，按照公式计算回收率，结果见
