Nrf2—ARE信号通路在外伤性脑损伤神经保护作用的机制研究

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn Nrf2—ARE信号通路在外伤性脑损伤神经保护作用的机制研究 作者：林正 曾博 尹康 来源：《中国现代医生》2013年第11期

[摘要] 目的 初步探讨Nrf2-ARE通路在外伤性脑损伤保护作用的机制。 方法 采用基因敲除大鼠制作创伤性脑损伤模型。将72只实验大鼠分为假手术组（Nrf2+/+）、脑损伤组（Nrf2+/+）、假手术组（Nrf2-/-）和脑损伤组（Nrf2-/-），每组18只。损伤36 h后，采用TUNEL法检测神经细胞凋亡及ELISA蛋白羰基试剂盒检测蛋白质氧化损伤程度。 结果 假手术组（Nrf2+/+）大鼠与假手术组（Nrf2-/-）大鼠相比，脑组织蛋白羰基浓度及神经细胞凋亡率均无显著差异（P > 0.05）；而脑损伤组（Nrf2+/+）大鼠及脑损伤组（Nrf2-/-）大鼠的脑组织蛋白羰基浓度及神经细胞凋亡率分别比假手术组（Nrf2+/+）大鼠与假手术组（Nrf2-/-）大鼠高，差异有统计学意义（P < 0.01），但脑损伤组（Nrf2-/-）大鼠的相关指标较脑损伤组（Nrf2+/+）明显增高，差异有统计学意义（P < 0.01）。 结论 Nrf2-ARE通路可能通过减低外伤性脑损伤中脑组织蛋白羰基的浓度，减少神经细胞的凋亡，从而发挥神经保护作用。

[关键词] 外伤性脑损伤；Nrf2-ARE通路；氧化应激；神经保护 [中图分类号] R651.1+5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）11-0011-03 外伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）指由外伤因素所致严重脑组织损害的一类疾病，已严重影响人类的健康[1]。其中，TBI后神经元继发性损伤（secondary brain injury，SBI）是造成脑损伤发生、发展的重要原因[2]。近年来，有研究者认为氧化应激损伤在外伤性脑损伤机制中占有重要的地位[3]。有研究结果表明Nrf2-ARE通路可能参与了TBI后内源性应激防御机制[4，5]，但其神经保护作用机制尚未得到完全阐明。因此，本研究采用外伤性脑损伤大鼠模型，观察Nrf2-ARE通路对TBI后大鼠神经细胞凋亡及氧化应激损伤指标的作用，探讨该通路在TBI后发挥神经细胞保护作用的相关机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物 （Nrf2-/-）大鼠及（Nrf2+/+）大鼠由浙江大学医学院动物实验中心提供。其中，前者DNA基因的引物序列为5’-GCGGATTGACCGTAATGGATAGG-3’，而后者DNA基因的引物序列为5’-CGCCTTTTCAGTAGATGGAGG-3’。所有大鼠均在自由饮食条件下饲养。

1.2 试剂和仪器 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 原位末端标记（TUNEL）试剂盒（Promega公司）；ProteinCarbonyls ELISA Kit试剂盒（R&D Systems公司，美国）；多功能酶标仪（BioTek 公司，美国）；Labo fuge 400R高速离心机（Heraeus公司，德国）；电子显微镜（OLYMPUS，日本）等。

1.3 动物模型制备及大鼠分组 采用BenchmarkTM法制备TBI动物模型[6]。过程如下：麻醉成功后，暴露颅骨。距矢状缝中线右1 mm，在人字缝与冠状缝处钻孔，直径约0.4 cm，打开硬脑膜。将撞击器装配在立体定位仪上，将撞击器的头端与冠状面平行，而与大鼠头颅矢状面呈8°角度垂直固定于硬脑膜上。采用2.5 mm直径的撞击头，以3.5 m/s撞击速度、0.8 mm打击深度、90 ms打击时间制作中度外伤性脑损伤。假手术组大鼠无冲击损伤过程，其余步骤同模型组。将基因敲除大鼠分四组：假手术组（Nrf2+/+组）、脑损伤组（Nrf2+/+组）、假手术组（Nrf2-/-组）和脑损伤组（Nrf2-/-组），每组18只。18只大鼠均在损伤36 h后处死，其中9只取右侧损伤灶脑组织，-70℃冰箱保存，待脑组织蛋白羰基的浓度检测；其余9只行TUNEL染色并在光镜下（×400）观察凋亡细胞。

1.4 指标检测 1.4.1 组织蛋白羰基浓度测定 严格按ProteinCarbonyls ELISA试剂盒步骤说明书操作测定。 1.4.2 TUNEL染色 严格按照试剂盒检测步骤进行操作。TUNEL染色在光镜下（×400）观察凋亡细胞（以胞核出现棕黄染色颗粒代表），计算TUNEL阳性率即TUNEL阳性细胞数占总细胞数的比值并采图。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件，所有数据均以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，相同基因型或不同基因型间两两比较均采用配对t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 组织蛋白羰基浓度比较 3 讨论 有研究表明，Nrf2作为一个重要的细胞内转录因子，对防御各种内源性应激损伤起到积极的调控作用且广泛分布于机体的各个组织器官中[7]。Nrf2属于CNC转录因子家族成员。CNC家族除Nrf2外，还包括P45、Nrf1和Nrf3，而其中Nrf2为细胞防御各种应激损伤的关键转录因子[8，9]。有研究报道，位于Ⅱ相解毒酶基因分子顺式作用元件的其中一段增强子序列的5’端中含有一个抗氧化反应基团，Nrf2-Maf异二聚体可与此处结合以增强其下游靶基因的表达，从而构成Nrf2诱导Ⅱ相酶基因表达的必需调节因子[10]。当受到活性氧或亲电子物质的信号攻龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 击后，Nrf2被磷酸化后从复合物中解离[11]，构成新异二聚体后又与抗氧化反应元件ARE上GCTGAGTCA位点结合，使下游靶基因的表达得以激活，进一步调节抗氧化酶蛋白，相继启动ARE作用的抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶的表达，如HO-1、NQO-1等，从而发挥神经细胞保护作用。最近，已有研究证实Nrf2-ARE通路在中枢神经细胞中发挥内源性抗氧化作用来减轻氧化应激所致的神经元损伤。但该通路是否具有保护脑外伤后的神经细胞的作用及其相关机制尚不明确。为尽量减少药理学局限性的干扰，更准确地了解Nrf2-ARE通路在外伤性脑损伤中的保护神经细胞作用及其机制，本研究采用Nrf2基因敲除大鼠对Nrf2在外伤性脑损伤中的作用及机制进行进一步的研究。

目前认为，在外伤性脑损伤的发生、发展的过程中，继发性损伤是非常重要的因素，它也是颅脑外伤后造成患者死亡和影响后续康复的主要原因。为此，积极治疗继发性脑损伤对于抢救患者的生命及改善预后具有积极的意义。本研究中从病理形态学（细胞凋亡）客观地评价继发性脑损伤。我们发现，脑损伤组（Nrf2+/+）及脑损伤组（Nrf2-/-）大鼠都出现不同程度的神经细胞凋亡，但后者较前者表现得更为严重，这提示Nrf2对外伤性脑损伤具有抗神经细胞凋亡的作用。这与既往研究报道中Nrf2可减少脑损伤的体积及改善急性脑血管病的神经细胞功能结果相一致[6，12]。

除此之外，我们还发现Nrf2-ARE通路对外伤性脑损伤后抗神经细胞凋亡的作用与其抑制氧化应激损伤有关。有研究表明，氧自由基在外伤性脑损伤后继发性脑损伤的发生、发展过程中起到了非常重要的作用。脑细胞损伤后，产生了大量的氧自由基，其一可直接使蛋白质、脂质及DNA过氧化，破坏细胞膜磷脂结构，促使蛋白质的降解、核酸主链的断裂、细胞的崩解及细胞发生一系列不可逆的病理改变；其二可通过刺激表达黏附分子和细胞因子，进一步介导炎症和免疫反应过程，从而加重受损的脑组织细胞功能损伤；其三，氧自由基还可通过抑制线粒体功能等间接途径使凋亡信号通路得以激活，引起神经细胞的凋亡[13]。上述环节互相影响、相互重叠，成恶性循环，最终导致神经细胞不可逆性坏死。在本研究中也发现，脑损伤组（Nrf2+/+）及脑损伤组（Nrf2-/-）大鼠损伤侧周边脑组织中蛋白质氧化损伤指标（蛋白羰基）的表达明显增高，故提示脑组织中出现氧化应激损伤，同时损伤侧脑皮层神经细胞凋亡率也明显升高，这与以往的研究也是相一致的，在一定程度上说明外伤性脑损伤后发生明显氧化应激损伤，从而导致神经细胞的凋亡。但脑损伤组（Nrf2+/+）及脑损伤组（Nrf2-/-）大鼠相比，后者氧化应激损伤指标表达及神经细胞凋亡率较前者更加明显，差异有统计学意义（P < 0.01）。既往研究也证实，Nrf2对新生儿缺氧性脑病、脑出血以及脑缺血后氧化应激及神经元损伤都具有保护性意义[14]，与本研究结果相一致。由此，我们认为Nrf2-ARE通路对于抑制外伤性脑损伤后氧化应激损伤，抗细胞凋亡具有十分重要的意义。

综上所述，本研究通过Nrf2敲除大鼠建立外伤性脑损伤模型，证实Nrf2-ARE通路在外伤性脑损伤中发挥了神经保护作用。其机制可能是通过抑制氧化应激损伤来实现，这为今后积极治疗外伤性脑损伤带来新策略奠定重要的理论基础。

[参考文献] 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn [1] Reilly P. The impact of neurotrauma on society： an international perspeetive[J]. Prog Brain Res，2007，161：3-9.

[2] Jennett B. Epidemiology of head injury[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry，1996，60（4）：362-369.

[3] Darwish RS，Amiridze N，Aarabi B. Nitrotyrosine as an oxidative stress marker： evidence for involvement in neurologic outcome in human traumatic brain injury[J]. J Trauma，2007，63（2）：439-442.

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[5] Clausen F，Lundqvist H，Ermark S，et al. Oxygen free radical dependent activation of extracellular signal-regulated kinase mediates apoptosis-likecell death after traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma，2004，21（9）：1168-1182.