IGY提纯与鉴定
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试验抗日本血吸虫卵黄抗体的制备与鉴定材料与方法1.1主要试剂正辛酸天津市弗晨化学试剂厂批号200101（分析纯）硫酸铵天津市四通化工厂（分析纯）3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）Amresco批号T2007/10二甲基亚砜（DMSO）郑州化学试剂厂批号20030224十二烷基磺酸（SDS）北京鼎国生物技术公司Sigma进口分装L5750丙烯酰胺沃德赛斯生物技术有限公司Sigma进口分装A8887 羊抗鸡IgY（FITC标记）Promega公司低分子量标准蛋白质中科院上海生物化学研究所DAB Amresco C069DTT Genview DH116-21.2 试剂的配制1.2.1 提取蛋白用试剂的配制（1）饱和硫酸铵溶液(NH4)2SO4760g，蒸馏水（50～80℃）1000mL搅拌溶解20分钟，趁热过滤冷却后以浓氨水（NH3·H2O）调PH至7.0～7.4，配制好的饱和硫酸铵置4℃处置30 min以上，瓶底应有结晶析出，用时应置室温平衡后再用。
（2）醋酸缓冲液（0.06M,pH4.8）醋酸钠 4.082g冰乙酸 1.815g（约1.7 mL ）1.2.1 ELISA用试剂（1）包被液（0.05M pH9.6 碳酸钠缓冲液）无水Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g 蒸馏水加至1000 mL（2）洗涤液（0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液）PBSTNaCL 8.0gKCL 0.2gKH2PO4 0.2gNa2HPO4•12H2O 2.9g吐温-20 0.5mL 蒸馏水加至1000 mL（3）封闭液（1% BSA－PBST）牛血清白蛋白（BSA）1g洗涤液PBST 100mL（4）底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液）0.1M柠檬酸(19.2g/L) 24.3mL0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7mL蒸馏水50mL（5）TMB底物使用液TMB储存液（100mg溶于10mLDMSO,4℃保存）100µL底物缓冲液10mL30%H2O2 10µL （临用新鲜配制）（6）终止液（2M H2SO4）H2SO4（96%）22.2mL蒸馏水177.8mL1.2.3 SDS-PAGE电泳用试剂(1)10%（w/v）SDS溶液十二烷基硫酸钠（SDS）10g蒸馏水100mL （室温保存）(2)10%（w/v）过硫酸铵（AP）过硫酸铵1g蒸馏水10mL （临用前新鲜配制, 4℃保存＜1周）（3）30%丙烯酰胺混合液丙烯酰胺29.2g二甲基双丙烯酰胺0.8g 蒸馏水定容至100mL，棕色瓶4℃贮存（4）分离胶缓冲液（1.5M pH8.8Tris-HCl）Tris 18.2g少量蒸馏水溶解HCl（1M）调pH至8.8 蒸馏水定容至100mL，4℃贮存（5）浓缩胶缓冲液（1.0M pH6.8Tris-HCl）Tris 12.1g少量蒸馏水溶解HCl（1M）调pH至6.8 蒸馏水定容至100mL，4℃贮存（6）2×LeammLi样品缓冲液10%SDS 4 mL甘油 2 mL1.0M pH6.8Tris-HCl2.8 mL（7）电极缓冲液（10×）Tris 30.3g甘氨酸144.2g十二烷基硫酸钠（SDS）10g 蒸馏水定容至1000mL，使用时10×稀释（8）染色液（0.25%（w/v）考马斯亮蓝R-250酸甲醇水染液）考马斯亮蓝R-250 1.25g甲醇227mL冰醋酸46mL蒸馏水227mL（9）脱色液（酸甲醇水脱色液）甲醇50mL冰醋酸75mL蒸馏水875mL1.3 耗材及主要仪器自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化器厂SZ-93型台式电子天平北京赛多利斯Acculab紫外可见分光光度计UV-2102倒置显微镜日本Nikon超声裂解仪Cole-Parmer Instrument公司自动酶联检测仪Anhos Labtee Instruments Gmbh公司台式离心机北京医用离心机厂LD5-2A型96孔酶标板江苏海门公司垂直电泳槽北京六一仪器厂电泳仪（DYY-5）北京六一仪器厂手动可调式移液枪大龙医疗设备（上海）有限公司荧光显微镜日本OLYMPUS1.4 方法1.4.1鸡群的免疫已做过1.4.2 检测鸡群卵黄抗体水平的间接ELISA方法的建立[70][71][72][73]间接ELISA程序按常规方法在96孔聚丙乙烯微量板上进行。
以日本血吸虫可溶性抗原按一定稀释倍数包被板子；0.05%的PBS-Tween20（PBST）液洗涤6次，1min每次；1%的BSA-PBST封闭，洗涤同上；加入待测卵黄液样品，37℃孵育；同上洗涤后加入酶标记兔抗鸡IgG，37℃孵育；洗涤后加入新配制的四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，室温显色；2M 的H2SO4终止反应，酶标仪上测定各孔450nm处的吸光值（OD450nm）。
1.4.5.1 抗原最适包被稀释度的确定将抗原用包被液（0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液）作1:50始倍比稀释包被酶标板，采集未免前鸡蛋为阴性卵黄作1:100 1:500 1:1000 1:2000稀释，四免后第15 d收集鸡蛋为阳性卵黄作1:1000 1:2000 1:4000 1:8000稀释，加入最佳工作浓度的酶标二抗，按间接ELISA方法进行，测定各孔OD450nm值，方阵法确定抗原最适包被浓度和抗体的最佳稀释度。
1.4.5.2 抗原最适包被时间和温度的确定将稀释的C.baileyi可溶性抗原以不同的方式包被，分别以4℃过夜（≥10 h），37℃孵育2h、10h后，加入阴阳性血清，按间接ELISA方法测定。
1.4.5.3 特异性试验阻断试验：将阳性鸡抗血吸虫卵黄液作1:100～1:1600稀释，每个稀释度加入等量稀释度的血吸虫可溶性抗原，37℃孵育阻断30min后，再进行ELISA测定，同时设相应对照，比较结果。
类属反应：对3份阳性鸡贝氏隐孢子虫卵黄样品按前述方法处理后进行ELISA测定，同步设血吸虫阳性卵黄、阴性卵黄作对照。
1.4.5.4 重复性试验选择5份鸡抗血吸虫卵黄液样品在不同时间、相同条件下重复作ELISA测定，每个样品重复3次，比较试验结果。
1.4.5.5 试验样品的检测试验分别采集实验组和对照组4免后第15 d卵黄样品各3份，用间接ELISA方法进行效价测定。
1.5 IgY抗体的收集纯化与测定1.5.1 IgY抗体的分离纯化1.5.1.1 IgY抗体的粗提取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液（约10ｍL/枚）与灭菌单蒸水（D.W）按1：9稀释，充分搅拌混匀，调PH值至5.1～5.4，置4℃，6h以上或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心10min （10,000rmin-1，4℃），弃沉淀，获取上清液，即为粗提的IgY抗体。
1.5.1.2 IgY抗体的体纯参照相关文献[66][67][68]以酸化水稀释-盐析法，用不同的盐类和浓度收集纯化卵黄中的IgY抗体。
卵黄的预处理同IgY抗体的粗体，以粗体的卵黄抗体进一步以盐析法纯化。
设置五种盐析法提纯IgY抗体，方法如下：方案1：水稀释一步硫酸铵盐析法，上述卵黄预处理上清，加入33%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS（0.01M,pH7.4）中，置常规处理过的透析袋中，流水透析过夜，次日以1：1000以上的PBS搅拌透析，3h左右换液一次，透析3d，获抗体蛋白，加入1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
方案2：水稀释二步硫酸铵盐析法，上述预处理上清，加入50%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入33%饱和硫酸铵，同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置超滤管3500rpm 离心25min，获抗体蛋白，加1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
方案3：水稀释二步硫酸钠盐析法，上述预处理上清，加入19%硫酸钠（W/V），搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入14%硫酸钠（W/V），同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
方案4：水稀释一步硫酸钠盐析法，上述预处理上清，加入19%硫酸钠（W/V），45℃水浴，充分搅拌2h左右，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
方案5：水稀释辛酸硫酸铵盐析法，上述预处理上清，加入3倍体积（0.06M,pH4.8）醋酸缓冲液，并调pH 值至4.5，上述处理的样品搅拌下缓慢加入正辛酸，30µL /ｍL样品，继续搅拌30 min以上，置4℃充分作用2h左右，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃沉淀，收集上清，10份上清加入1份PBS（0.02M,pH7.4），调pH 值至7.4，搅拌下加入33%饱和度的饱和硫酸铵溶液，继续搅拌30 min以上，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
1.5.2 IgY抗体的纯度测定用SDS-PAGE方法，比较不同盐析方法纯化抗体所达到的纯度。
参照文献[61][69]分别配制8%分离胶，5%浓缩胶，装入电泳仪，浓缩胶电压40V，当染料前沿进入分离胶后，将电压提高到80V，染料前沿到达距分离胶底部1cm时关闭电源，置考马氏亮兰R-250染色液，室温染色4h或过夜，转至脱色液中脱色，至凝胶背底透明，蛋白条带清晰，判读结果并拍照后，置保存液4℃保存。
1.5.3 纯化IgY抗体的蛋白质浓度测定紫外分光光度计测所提取IgY抗体的蛋白含量，计算各种提纯方法提取的蛋白含量。
1.6 IgY抗体的鉴定1.6.1 IgY抗体的效价测定收集卵黄从1：1000开始作倍比稀释，按建立的ELISA方法测定免疫不同时间的卵黄抗体效价。
1.6.2 IgY的SDS-PAGE分析参照相关文献[61][69]进行，配制5%的浓缩胶，8%分离胶，装入电泳设备，加入不同方法提纯的IgY抗体样品、未提纯前样品、低分子标准蛋白样品以及鸡血清IgG作对照，起始压为80V，待样品前沿至分离胶时调电压为130V，电泳样品距胶底lcm处停止电泳，置室温下考马斯亮蓝R-250染色液，染色4 h或过夜，脱色液充分脱色，至呈现出清晰蛋白条带，判读结果并拍照后，置保存液4℃保存。
