(完整版)北京大学医学部攻读硕-博士学位研究生课题研究计划书

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北京大学医学部
攻读 博 硕 士学位研究生课题研究计划书

研 究 生 李玉霞
学 号 1411210743
年 级 2014级
院 (部) 北京大学/香港科技大学医学中心
专 业 医学生物化学与分子生物学
导 师 方征宇

课题研究开始日期: 2015年 03 月 09 日

北京大学研究生院医学部分院培养办公室制表
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说 明
一、 本计划书由研究生本人在本学科内作过开题报告后填
写,一式三份;经院(部)主管部门批准后一份留教研室,
一份留院(部)主管部门,一份送研究生院医学部分院
培养办公室备案。
二、 计划批准后不得随意更改。如有特殊情况确需变更者,
需填写变更报告,逐级审批。
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研究课题名称
黑色素瘤顺铂获得性耐药相关microRNA筛选及其功能的研究

研究课题的目的、理论与实际意义、国内外研究情况简介
课题的目的:
1、构建黑色素瘤顺铂获得性耐药细胞株,与其原始株进行microRNA的高通量筛选比较,找到
耐药相关的microRNA,作为潜在的治疗靶点。
2、分析耐药相关microRNA通过调控哪些基因的表达来影响黑色素瘤细胞的耐药性,阐明其分
子机制。

理论与实际意义:
近几十年来,恶性黑色素瘤在全球的发病率迅猛升高,成为所有恶性肿瘤中发病率增长
最快的肿瘤,年增长率几乎达到3-5%。其中白色人种发病率明显高于其他人种, ,我国和日本
等亚洲国家的黑色素瘤发病率与欧美国家相比相对较低,但近年来其发病率呈迅猛上升趋
势。恶性黑色素瘤治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学药物治疗及生物免疫治疗等。
化疗在恶性黑色素瘤治疗中仍占有重要地位。目前化疗药物主要有顺铂、长春新碱和组蛋
白去乙酰化酶抑制剂等。顺铂是现在临床上多种化疗方案中的主要药物之一,通过与癌细胞
的脱氧核糖核酸发生交叉联结,诱导肿瘤细胞的凋亡而起抗癌作用,属细胞增殖周期非特异
性药物,但是多种恶性黑色素瘤常会对顺铂产生天然或获得性耐药,因而提高顺铂的抗肿瘤
作用,解决顺铂耐药在恶性黑色素瘤的化疗中有着重要的实际意义。 顺铂耐药机制,主要包
括细胞内药物积累的减少,DNA损伤修复作用增强,凋亡通路的变化以及一些microRNA的
异常表达。由于microRNA的表达易于调控,如果能找到黑色素瘤中与耐药相关的microRNA,
可建立以此为靶点的干预手段。

国内外研究情况简介:
在其他肿瘤细胞中,已经有人验证出一些microRNA的变化会影响肿瘤对顺铂的敏感
性,而目前关于microRNA在黑色素瘤顺铂获得性耐药机制中的作用研究较少。
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主要研究内容
研究内容1:构建黑色素瘤顺铂耐药株
选取了七种黑色素瘤细胞系M7、M21 、SK-MEL-103、M29 、A375、M8 、SK-MEL-19依
次检测对顺铂的敏感性,在对顺铂比较耐受的细胞株中选取了A375、M8、SK-MEL-19构建了顺
铂耐药株并将A375、M8做了microRNA的表达谱芯片。

研究内容2:黑色素瘤顺铂耐药株与原始株microRNA芯片分析及验证
通过分析microRNA表达谱芯片,对黑色素瘤顺铂耐药株中异常表达的microRNA用荧光
定量PCR进行验证,确定要研究的microRNA。

研究内容3: 顺铂耐药相关基因反向筛选预测microRNA
查阅文献,汇总顺铂耐药相关基因,在黑色素瘤顺铂耐药株与原始株中用荧光定量PCR
验证,根据耐药基因的变化反向预测microRNA。

研究内容4:microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制
根据microRNA靶基因预测数据库找到靶基因,进一步研究microRNA对顺铂黑色素瘤耐
药的影响及其分子机制。
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主要研究方法
1、 构建黑色素瘤顺铂耐药株
MTS法检测药物敏感性以及顺铂耐药株的耐药指数。
2、 黑色素瘤顺铂耐药株与原始株microRNA芯片分析及验证
Real-time PCR验证microRNA芯片结果。
3、 顺铂耐药相关基因反向筛选预测microRNA
Real-time PCR验证顺铂耐药相关基因,microRNA靶基因预测数据库分析结果。
4、 microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制
Dual-Luciferase Reporter验证microRNA与靶基因的关系,慢病毒构建靶基因相关稳转株,
Western Blotting验证靶基因相关蛋白的变化。

研究进度及具体安排
2015年3月-2015年8月进度:黑色素瘤顺铂耐药株构建
2015年9月-2015年12月进度:microRNA芯片分析及验证,顺铂耐药相关基因的筛选
2016年1月-2016年10月安排:microRNA对黑色素瘤顺铂耐药的影响及其分子机制的研究

预期结果
1、 通过microRNA芯片找到与黑色素瘤顺铂耐药相关的microRNA
2、 通过microRNA靶基因预测数据库找到microRNA的靶基因
3、 microRNA的靶基因通过调节细胞内的相关蛋白对顺铂耐药有作用,通过敲除或者过表达该
基因可以逆转黑色素瘤顺铂获得性耐药。
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协助导师具体指导的人员配备
周游博士后、细胞培养技术员黎满慧、试剂采购技术员董小林

主要仪器设备情况
Bio-Rad PCR仪、Bio-Rad Rael-time PCR仪、Bio-Rad 酶标仪、Bio-Rad 蛋白电泳仪、
Eppendorf 离心机、Stuart涡旋振荡器、Wise Therm 干浴锅、超净台、显微镜、-20℃
冰箱等

实验动物情况
没有动物实验

药物试剂等来源情况
DMEM(GIBCO)、PBS(Invitrogen)、Tyrisin(GIBCO)、MTS(Promega)、
Lipofection2000(Promega)、RT kit(Promega)、Real-time supermix (Promega)、
BCA(TransGen Biotech)、BSA(sigma)等。

协作单位及协作内容落实情况
没有

其它
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导师审查意见:
导师签名:
年 月 日

教研室(研究室)审查意见:

主任签名:
年 月 日

院(部)主管部门审批意见:

院(部)盖章:
年 月 日