石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织的采集、固定和保存：
采取组织后，
方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜
方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）
PBS缓冲液洗三次，每次5min，4︒C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54︒C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10μm，贴于处理过的干净载玻片上，37︒C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：
保存于4︒C 70%乙醇中的组织样品
↓
80%乙醇15 min
↓
95%乙醇15 min
↓
100%乙醇15min ⨯ 2
↓
1/2乙醇1/2二甲苯15 min
↓
二甲苯透明5-10 min
↓
1/2二甲苯1/2石蜡30 min
↓
石蜡（1） 1.5hr
↓
石蜡（2） 1.5-2.5hr
↓
石蜡（3）包埋
↓
RT保存
3、石蜡组织切片的免疫组化方法：
密封保存于RT的组织切片
↓
二甲苯(1) 20 min
↓
二甲苯(2) 20 min
↓
100%乙醇20min
↓
95%乙醇10 min
↓
80%乙醇10 min
↓
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
↓
切片在PBS中浸泡 5 min*2
↓
0.4%Tritonx RT 10 min
↓
切片在PBS中浸泡 5 min*3
3%H2O2 RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
0.25%胰酶RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT
60min
倾去blocking buffer，勿洗
一抗4︒C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h
切片在PBS中浸泡 5 min*3
DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）
如果是增强型DAB只要1min即可。
切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s，
玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。
若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久）
脱水85%乙醇 5 min
↓
95%乙醇 5 min
↓
无水乙醇 5 min
↓
无水乙醇5min
↓
二甲苯(1) 10min
↓
二甲苯(2) 10min
↓
中性树胶封片，室温干燥保存
4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：
密封保存于RT的组织切片
↓
二甲苯(1) 20 min
↓
二甲苯(2) 20 min
↓
100%乙醇20min
↓
95%乙醇10 min
↓
80%乙醇10 min
↓
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
↓
切片在PBS中浸泡 5 min*2
↓
0.4%Tritonx RT 10 min
↓
切片在PBS中浸泡 5 min*3
切片在PBS中浸泡 5 min*3
0.25%胰酶RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT
60min
倾去blocking buffer，勿洗
一抗4︒C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1000，GAM-488 1：1000RT 1h DAPI（1：1000请根据二抗说明稀释二抗）
切片在PBS中浸泡 5 min*3
moil封片，避光4 C保存
