陈念-《非水短肽合成》

《Review : Proteinase Catalysed Short-Peptides Synthesis（2ed.）》

2002 Jie, Biochemistry and Molecular Biology Department, Life Science College ,

Southern China Agriculature University ,

(Guided Teacher: Xiang Yang.Gao , Editor: Nian Chen)

Content

1.Preclude

1.1.The significances of short peptide synthesis

1.2.The excellence and shortcomings of enzyme-catalyzed synthesis compared with

other synthesis methods

2. The mechanisms of enzyme-catalyzed peptides synthensis in organic solvent

3.The influencing factors

3.1.Factors of the enzyme

3.1.1Preparation

3.1.2The pH and the ion strength of the buffer

3.2Carrier

3.2.1The methods of the enzyme-immobiliation

3.3Modification

3.3.1Modification of the enzyme

3.4The solvent system

3.4.1The characters of the solvent system

3.5The characters of the reactant and the offspring

3.5.1. The solubility and concentration of the reactants

3.5.2. The water content and activity

3.5.3.The hydrophobility of the protecting groups

3.6.Other factors

3.6.1.Temperature

3.6.2.Salts added into the reaction system

3.6.3 Polarity additives

4. Summary

4.1Key problems need to be solved in the peptide sythensis

5. Accessary tables

5.1.The collections of the examples about short peptide synthesis

5.2.LogP datas of some organic media

5.3.LogP datas of some enayme carrier

6.Postscripts

《蛋白水解酶催化短肽合成研究综述（第二版）》

华南农业大学生命科学学院2002届生物化学与分子生物学专业

（作者： 陈 念 指导老师：高 向 阳）

一．前 言

（一）肽合成的意义

1.现代生物代谢研究发现：人类摄取蛋白质经消化道的多种酶水解后，并非完全以氨基酸的形式吸收，更多是以低肽形式直接吸收，而且二肽三肽的吸收比同一组成的氨基酸快。其中某些低肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，且同时具有促进矿质吸收、提高肌体免疫力等重要的生理功能。

2.生物活性肽是一类多功能因子，它们涉及许多生理代谢和调节功能。日本利用生物活性肽以开发出许多功能性食品，取得了良好的经济和社会效益。

（二）相对其它方法酶法肽合成的优、缺点

1.(居乃虎[])酶反应通常是在水为介质的系统中进行的，但是，人们研究发现，在有机介质中酶反应也能进行。近来，核磁共振、X-射线衍射和傅立叶变换红外光谱的研究表明，在非水相中，酶分子结构中α-螺旋含量减少，β-折叠含量增加二级结构的有序性增加，因而，提高了酶的稳定性。目前，非水系统中的酶催化作用已广泛的用于药物、生物大分子、肽类、手性化合物化学中间体和非天然产物等的有机合成，引起人们的极大关注。

2有机介质中的酶促反应（尤其是合成只含几个氨基酸的小肽片段）较传统化学合成法有明显优势：

a能催化水中不能进行的反应，可以使反应平衡由水解向肽合成方向逆转

b酶的立体专一性强，避免了化学法合成中产物的消旋问题

c较少用侧链保护基；可抑制由水等引起的副反应（例如水会使酶分子形成不规则结构、二硫键被破坏、Asp肽键水解、Asn和Gln残基脱酰胺、酰卤和酸酐水解）；且无微生物污染

d可提高疏水性底物（氨基酸及脂类衍生物）的溶解度，利于高浓度底物连续生物转化

e 酶源广泛，也可通过微生物发酵生产制备大量的酶

f固定化可以提高酶的稳定性

g酶不易溶于有机介质利于回收再利用；而且从低沸点溶剂中分离纯化产物也比水中容易 h 酶能合成或转化大量有机物，绝大多数有机化合物在非水系统中溶解度高

i酶反应条件温和，可催化很多对酸、碱敏感的分子参加的反应

3.亲水氨基酸在有机溶剂中溶解度小，而且多数蛋白酶不能以D型氨基酸为底物，故在方法上含上述两种氨基酸的肽的合成有待改进。有机溶剂中脂肪酶也有合成肽键的功能，而且其无酰胺酶活性，肽的水解被抑制，这对寡肽合成有利，而蛋白酶相对来说稳定性较差，而且水的存在可能使肽降解（此处来源待查－文献11[25/26]）。

二．酶有机相催化肽合成的机理

1.从宏观分析：一些蛋白解酶、羧酸脂酶在有机溶剂中底物专一性完全逆转，原因在于越亲水的底物与水形成的氢键越强，从而不利于酶－底物络合物的形成，使得在水中，氨基酸优先与水形成亲键；在有机溶剂中，则是氨基酸优先与酶结合。

2.Klibanov（1977）[]以及Martinek[]对有机介质中酶促合成机理进行过详细的讨论。认为有机相和水相的体积比（α）以及反应底产物在两相中的分配系数（Pi）决定了水-有机溶剂体系和单一水相中酶促肽合成的有效平衡常数的比值（K/Kw）。在一般两相体系中，可以假设α和Pi约等于100，则可以推导出（公式见文献1）K＞2500Kw，这从理论上解释了为什么蛋白水解酶在有机溶剂中会催化肽合成反应。

3.水解反应是合成肽的竞争性反应，水解反应强弱直接影响肽合成产率。在有机介质中合成小肽的关键问题是在实践中如何提高肽产物收率。目前，酶合成多肽较常采用的方法有两种：

（1）通过热力学控制的平衡合成（特点：通过控制温度、有机辅助溶剂、形成不溶产物改变反应平衡，速度较慢）。在热力学控制的肽合成中，最佳pH相对较低，这是因为在pH提高使非质子化亲核体浓度增加的同时羧基组分的离子化程度也会增加，两者相互平衡的结果使pH不可能太高。（Blanco R M文献23[12]）

（2）通过动力学控制的非平衡合成，首先是N-保护的氨基酸酯与酶快速反应形成活泼的酰基化酶中间体，此中间体迅速与亲核试剂（氨基酸酯或氨基酸酰胺）进行转酯化反应生成肽。在动力学控制的肽合成中，进攻酰化酶中间体的亲核体一般不带电荷，当溶液pH高于亲核体pKb两个单位时，亲核体会有98％去质子化，利于平衡向肽键形成反向移动。然而pH值过高，[OH]浓度增加又会导致水解反应发生。（Wilson S A文献23[15]）

三．影响酶（木瓜蛋白酶）有机相催化肽合成的因素

A酶本身

（一）酶的制备

1. Noritomi H[]在有机溶剂中，酶活也是制备方法的函数，制备方法还会影响酶的其它催化性质。这是因为蛋白质脱水冻干后构象会发生不可逆变化，制备方法不同会形成不同的构象。

2. Zaks A.[]发现酶在有机溶剂中能保持酶冻干前一定pH和离子强度缓冲液的构象，两者最适pH一致，这称为酶的“记忆”功能。因此可以通过在酶冻干前加入底物类似物等配体可将酶的催化构象“锁住”，使之高活性构象形式在有机溶剂中得以保持，以增加酶的活力，这种技术称为分子印迹（molecular imprinting）。在水溶液中，这种印迹则容易失去。K Dabulis .[]研究了四种蛋白酶和三种脂肪酶发现，酶与配体共存的水溶液经冷冻干燥，比没有配体的活力大大提高。配体是指酶的抑制剂或抑制剂类似物，另外一些冷冻干燥剂(lyoprotectants)(如PEG、山梨醇、甘露醇、海藻糖)和附形剂（excipient）也可以起到类似作用。生物印迹的修饰方法(待查！参见文献35[14、15、16])。

3.（文献35[17]）Okahata[] 还发现印迹可以提高脂肪酶在无水异辛烷中催化苯乙醇和月桂酸的酯化反应的对映体选择性。

4.因此，制备酶时应使用具有最适pH和离子强度的缓冲溶液溶解在冷冻干燥，以保证有机溶剂中酶的微环境具有最适pH值。

5.在制备酶的过程中，还应注意一些问题：所使用的酶尽可能纯化，以减少杂质干扰，提高重复性；酶的反应活性与立体选择性受制备过程中酶颗粒聚结的影响很大。如果先把纯化过的酶溶解于缓冲溶液中，然后再加入有机溶剂，酶不易聚结分散性较好；控制酶的颗粒大小，颗粒小可以增大酶与有机溶剂的界面，提高反应速度。

6.（文献19[18]）Fabur K[]发现，同一种脂肪酶，即使不同的来源对pH的敏感程度也不同。

7.（文献7[17]）加酶量对反应速率也会有影响

（二）缓冲液pH和离子强度

1.缓冲液有三个重要因子：pH、缓冲液类型（注意！）、缓冲液用量（待查，文献33[16]）。

2.在冻干前，用缓冲液调pH值对提高酶活有一定作用，但复杂的反应体系影响会造成蛋白质表面的电荷重新分布，如酸碱参加的反应。由于体系中有机相占绝大多数，故直接测定pH值会很困难。

3.由于酶活性基团的离子化状态与活力关系密切，（待查，文献33[18]）用有机相缓冲液（氨基酸－氨基酸氯盐对）控制低水有机介质中的酸碱条件，通过影响酶分子离子化状态来影响酶活。

4.酶催化反应的最适缓冲液pH值和离子强度除与酶本身来源和底物的pK影响，还与载体带电性质有关。Zhang[]利用固定化木瓜蛋白酶合成各种二肽时发现，不带电荷的载体适于较低的离子强度，而带电荷的载体则需较高离子强度。

B载体

（三）酶的固定化载体和方法

1.在生物体物质的转化中，许多酶是以与膜结合的状态行使功能的，如催化亲酯