色氨酸发酵设计-

江西科技师范学院发酵工程课程设计报告书专业：生物工程班级：2007级1班姓名：王斌欧清礼庞胜设计题目：色氨酸发酵工艺设计指导教师：常军博士2010年11月22日题目：色氨酸发酵工艺设计条件：年产量100吨要求：（1）分批发酵生产；（2）主发酵罐的尺寸及附件的设计；前言L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸,为白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，在水中溶解度1014 g（25℃），溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。

微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。

它是人体和动物生命活动中必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，被称为第二必需氨基酸，在生物体内，从L-色氨酸出发可以合成5-羟基色胺的激素以及色素、生物碱、辅酶、植物激素等生理活性物质，可以预防和治疗糙皮病，同时具有消除精神紧张、改善睡眠等功效。

另外，由于色氨酸是一些植物蛋白中比较缺乏的氨基酸，用他强化食品和做饲料添加剂对提高植物蛋白质的利用率具有重要的作业，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。

[1]目前世界L-色氨酸的年产约为10000多吨，市场增长率超过10%，作为饲料添加剂使用的色氨酸有数百吨，中国主要是高价格限制了她的应用。

世界上主要生产厂家是日本的昭和电工、协和发酵和三井化学公司采用发酵方法生产色氨酸，赢创德固赛则兼有发酵法和合成法生产色氨酸。

[2]L-色氨酸的最早生产是靠化学合成法和蛋白质水解法，随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，这种方法已经处于主导地位。

微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。

目录1概述 (1)1.1色氨酸发酵工艺流程 (1)1.2色氨酸发酵菌种 (1)1.3发酵过程中的代谢参数 (1)1.3.1 物理参数 (1)1.3.2 化学参数 (3)1.3.3 生物参数 (4)1.3.4发酵终点的判断 (5)1.3.5发酵过程的自动控制 (5)1.4 培养基配方的确定 (5)1.4.1种子罐培养基配方 (5)1.4.2发酵罐培养基配方 (6)1.4.3培养基的灭菌 (6)2发酵罐及其附属设备 (7)2.1发酵罐的结构形式 (7)2.1.1物料衡算： (7)2.1.2罐的几何尺寸 (7)2.1.3通气和搅拌 (9)2.1.4 搅拌器选型和搅拌功率计算 (9)2.1.5挡板数 (10)2.1.6传热 (10)2.2.1空气处理系统 (11)2.2.1.1空气的预处理 (11)2.2.2管道及阀门 (13)2.2.3蒸汽及空气用量 (13)3部分符号说明 (1)4总结 (2)5参考文献 (3)1概述1.1色氨酸发酵工艺流程色氨酸生产菌的选育一般是以大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸杆菌等作为出发菌株，通过基因操作定向改造生物合成途径的正常调节。

表1 色氨酸发酵工艺流程图发酵液↓板框过滤滤液↓树脂吸附与解析解析液↓纳滤浓缩浓缩液↓洗涤洗涤液↓活性炭脱色脱色液↓喷雾干燥精粉1.2色氨酸发酵菌种本设计选用E.coli 基因工程菌，其发酵单位为25 g/L1.3发酵过程中的代谢参数1.3.1 物理参数1.3.1.1温度对发酵的影响及调控大肠杆菌的最适生长温度为37℃，温度过高，会影响产物表达和乙酸等副产物的生产，同时，在基因工程菌高密度培养过程中，温度的变化还与质粒拷贝数的变化有关。

在发酵前期，色氨酸的浓度随着细胞的生长而逐渐提高，但进入生长稳定期后，影响色氨酸合成因素除了细胞生物量外，还有质粒的稳定性。

当温度为32℃时，产酸水平达到最大值，过低或过高的温度均不利于色氨酸的合成；36℃时虽然获得了最高的菌体量，但产酸却不是最高，质粒丢失比较严重；28℃时，质粒基本不会丢失，但过低的温度使菌体生长缓慢，产酸下降。

因此，在本次设计中，色氨酸发酵过程中温度控制策略为：0~16h发酵温度为30℃，16h后缓慢升温至36℃，升温方式为每小时0.5℃，利用发酵罐的温度顺控模式进行自动控制。

表2 色氨酸发酵过程中的温度顺序控制表时间（h）温度（℃）时间（h）温度（℃）时间（h）温度（℃）0 30 22 32.5 27 3518 30.5 23 33 26 35.519 31 24 33.5 29 3620 31.5 25 34 45 3621 32 26 34.51.3.1.2泡沫对发酵的影响及调控发酵过程中因通气搅拌和代谢产生的气体是产生泡沫的原因。

产生少量泡沫是正常的，但是泡沫产生过多时会造成大量逃液，发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会，严重时还会影响通气搅拌的正常进行，从而影响菌的呼吸。

调控方法：使用消泡剂同时采用机械强烈震动或压力变化进行消泡。

1.3.1.3发酵罐压力发酵过程中发酵罐应维持一定的正压力，这样可以防止因外界空气中的杂菌侵入而污染发酵液。

同时罐压的高低还与氧和二氧化碳在培养液中的溶解度有关，间接影响代谢。

罐内压力一般维持在2×104 ～5×104 Pa。

1.3.2 化学参数1.3.2.1溶氧浓度对发酵的影响及调控大肠杆菌为兼性厌氧菌，在其生长期时需要大量的氧气，但是在发酵过程中，表现出厌氧的性质。

所以在发酵前期应保持一定的通风量，在发酵时减少通风量。

根据经验值，在大肠杆菌生长阶段，溶解氧浓度为30%，在产酸阶段的溶解氧浓度为20%，有利于菌体的生长及以后的发酵。

调控：氧浓度低，可以增大搅拌功率，增加通气量或选用氧载体等，若氧浓度增高，则减慢搅拌速率，减小通气量，同时控制补料速度。

1.3.2.2 pH 对发酵的影响及调控pH 对生产菌的生长具有非常明显的影响，因其影响生产菌的酶活性，改变细胞膜的通透性，影响培养基中某些组分中间代谢产物的解离，从而影响菌体对营养物质的吸收，改变菌体的代谢途径，从而使产物产量下降。

调控：在线检测发酵液的pH ，根据发酵的不同阶段对发酵液PH 值进行调控，在发酵液pH 值不稳定的时候可以选择加简单的酸碱盐，铵盐，或同时加入表3 发酵过程中物理参数的测量方法和意义名称测定方法 意义及主要作用 发酵温度/℃或K温度计 保证生长，繁殖和产物合成 发酵罐压力/Pa 或㎏·m -2压力计 维持正压，增加溶氧量 空气流量/m 3·min-1或L·min -1流量计 供养、排出废气 搅拌转速/r·min -1转速表 使物料和气体混合 发酵液黏度/Pa·s粘度计 反映菌生长情况 发酵罐装量/m 3或L液位计 反映发酵生产批量 发酵液密度/g·L -1加消泡剂/㎏ 密度计 反映发酵液性质 流量计 反映发酵液性质和代谢情况碳氮源等方法来调节发酵液pH值。

在本设计中，主要加入氨水来调节pH值。

1.3.2.3 CO2对发酵的影响及调控CO2对生产有抑制作用，当CO2浓度过高时将严重抑制菌体的生长，影响产物的合成。

同时CO2浓度过高生成大量的HCO3-，使溶液pH值降低，影响生产菌细胞膜通透性，从而影响产物产量。

调控：调整搅拌速率与通气量，定时检测CO2 的释放率。

表4 发酵过程中化学参数的测量方法和意义名称测定方法意义及主要作用酸碱度（pH）pH传感器反映菌体的代谢情况溶解氧/mg·L-1溶氧传感器反映氧的供给和消耗情况排气氧浓度/Pa 氧传感器了解氧的消耗情况氧化还原电势/mV 电势传感器反映菌体的代谢情况排气二氧化碳/％红外吸收了解菌体的呼吸情况氨基酸浓度/mg·mL-1取样测定了解氨基酸的变换情况总糖和还原糖/g·L-1取样测定了解糖的变化和消耗情况前体或中间体/ mg·mL-1取样测定了解产物合成情况无机盐浓度（Fe2+,NH4+）/mol取样测定了解无机离子对发酵的影响或％1.3.3 生物参数1.3.3.1菌体浓度对发酵的影响及调控菌体浓度的大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响，更是对发酵产物的得率有着重要的影响。

根据发酵产物产率P=Q Pm C(X)[Q Pm——最大生成速率：C(X)——菌体浓度][3]得出，菌浓度越大，产物的产量也就越大。

但是如果菌体浓度过高，就会产生营养物质消耗过快，发酵液营养成分发生明显变化。

同时由于菌体浓度过高，发酵液粘度增加，溶氧量减少，进一步影响发酵的进行。

调控：定时抽取发酵液，测量OD值。

依靠调节发酵液各成分的的比例，将菌体浓度控制在合适范围内，避免产生过浓的菌体量。

1.3.3.2基质溶度对发酵的影响及调控即发酵液中碳、氮重要营养物质浓度，他们的含量对生产菌的生长和产物的合成由着重要影响。

若碳源过高，则容易造成较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。

若氮源过高，会是菌体生长过于旺盛，pH 偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。

调控：定时抽取发酵液，测定碳、氮等基质的浓度。

1.3.3.3染菌对发酵的影响及调控发酵过程中应严格防止污染杂菌，杂菌会造成发酵液营养物质的迅速消耗，同发酵菌产生竞争作用，降低产量。

若是在发酵后期污染少量杂菌，则影响不大。

调控：定时抽取发酵液进行检测，检查是否有杂菌污染。

主要方法有：平板划线培养或者斜面培养检查法，显微镜检查法，肉汤培养法。

发现发酵液被杂菌污染，视发酵阶段不同，处理方法也不同：若在种子培养期染菌，则经灭菌后弃之，然后对种子罐、管道等进行仔细检查及彻底灭菌；若发酵前期染菌，则可将培养基重新灭菌，再接入种子进行发酵；若中后期染菌，如轻微染菌，则加入适当的杀菌剂或抗生素及正常的发酵液等。

发酵液中一般加入50µg/ml的四环素。

1.3.4发酵终点的判断发酵时间需要考虑经济因素，以最低的成本来获得最大生产能力的时间为最适发酵时间。

放罐过早，营养成分得不到有效利用，对成本造成浪费；放罐过晚，菌体自溶，加大后期产物的分离纯化的难度，还会使产品的产量降低。

一般判断放罐时间的主要指标有产物浓度、氨基氮、菌体形态、pH值、培养液的外观、粘度等。

1.3.5发酵过程的自动控制自动控制系统由控制器和被控对象两个基本因素组成。

发酵过程采用的基本自控主要有前馈控制，反馈控制和自适控制。

本设计采用反馈控制。

原理：被控过程的输出量X (t)被传感器检测，以检测量Y(t)反馈到控制系统，控制器使之与预定的值r(t)（设定点）进行比较，得出偏差e，然后采用某种控制算法根据这一偏差e确定控制动作U(t)[4]。

1.4 培养基配方的确定1.4.1种子罐培养基配方表5 种子灌培养基配方葡萄糖硫酸铵玉米浆豆饼水解液MgSO4·7H2OFeSO4·7H2OKH2PO4MnSO4.H2OPH3% 0.5% 4.0ml 2.0ml 0.04% 0.001% 0.1% 0.001% 7.0~ 7.21.4.2发酵罐培养基配方表6 发酵培养基配方（g/l）葡萄糖130玉米浆22ml豆饼水解液25ml(NH4)2SO440Phe 0.15Tyr 0.15MgSO4·7H2O 0.4MnSO4·H2O 0.01FeSO4·7H2O 0.01VB1100µgVH 50µg1.4.3培养基的灭菌对于液体培养基，我国仍采用蒸汽加热灭菌的较多。