高效木质素降解菌株的分离筛选

浙江大学学报（农业与生命科学版）　３７（３）：２５９～２６２，２０１１　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ａｇｒｉｃ．８Ｌ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．）　

文章编号：１００８—９２０９（２０１１）０３—０２５９—０４　ＤＯＩ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８—９２０９．２０１１．０３．００４　

高效木质素降解菌株的分离筛选　

燕红　一，苏俊　，于彩莲。，艾恒雨。，张晓甜。　（１．东北林业大学博士后科研流动站，黑龙江哈尔滨１５００４０；　２．黑龙江省农业科学院博士后科研工作站，黑龙江哈尔滨１５００８６　３．哈尔滨理工大学化学与环境工程学院，黑龙江哈尔滨１５００４０）　

摘　要：为筛选能高效降解木质素的菌株，从３１份采集的朽木和土壤样品中分离纯化获得１５５株茵；　将纯化获得的菌株接入到含愈创木酚的选择培养基上进行初筛，观察其颜色变化，根据菌落圈和变色圈　直径的比值，筛选出９株可降解木质素的菌株；将这９株茵接入产酶培养基中进行液体静止培养并测定　木质素酶活力，最终获得２株高产木质素酶的真茵茵株ｌ４—７和１５—１．将这２株真菌培养７　ｄ后，所产木　质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的活力分别为０．０８７、０．０６０、０．１４４和０．０７０、０．０５９、０．０００　Ｕ．ｍＬ　．　

关　键　词：木质素；木质素酶；木质素降解菌；分离筛选　中图分类号：Ｑ　９３９．９；Ｘ１７２　文献标志码：Ａ　

ＹＡＮ　Ｈｏｎｇ　，　一，ＳＵ　Ｊｕｎ　，ＹＵ　Ｃａｉ—ｌｉａｎ。，ＡＩ　Ｈｅｎｇ—ｙｕ。，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ—ｔｉａｎ。（１．Ｐｏｓｔ—ｄｏｃｔｏｒａｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００４０，Ｃｈｉｎａ　２．Ｗｏｒｋ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　Ｐｏｓｔ—ｄｏｃｔｏｒａｔｅ．Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ　１　５００８６，　Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈａｒｂｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００４０，Ｃｈｉｎａ）　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｆｕｎｇａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｉｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ａｇｒｉｃ．８Ｌ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．），２０１１，３７（３）：２５９—２６２　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　１５５　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｏｔ－ｗｏｏｄ　ａｎｄ　ｓｏｉｌ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ　ｅｎｚｖｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｎｉｎｅ　ｆｕｎｇｉ　ｗｈｉｃｈ　ｓｈｏｗｅｄ　ｃｏｌｏｒ—ｚｏｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｕａｉａｃｏｌｓ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｂｙ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｔａｔｉｃ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｉｌｔｒａｔｅｓ，ｔｗｏ　ｆｕｎｇａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ（ｔｅｒｍｅｄ　１４—７　ａｎｄ　１５－１，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈｅｒ［ｉｇｎｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｏｓｅ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｌｉｇｎｉｎ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，　ｍａｎｇａｎｅｓｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ｌａｃｃａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｆｕｎｇａｌ　ｓｔｒａｉｎ　１４—７　ｗｅｒｅ　ｕｐ　ｔｏ　０．０８７，０．０６０，ａｎｄ　０．１４４　Ｕ・　ｍＬ＿。．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ。ａｆｔｅｒ　７　ｄ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｓｔｒａｉｎ　１５－１　ｗｅｒｅ　ｕｐ　ｔＯ　０．０７０，０．０５９，ａｎｄ　０．０００　Ｕ．ｍＬ～，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｉｇｎｉｎ；ｌｉｇｎｉｎａｓｅ；ｌｉｇｎｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｆｕｎｇｕｓ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　

收稿日期：２０１０—０５—１３　基金项目：黑龙江省博士后基金资助项目（ＬＢＨ—Ｚ０７０１４）；黑龙江省教育厅面上资助项目（１１５３１０４５）．　作者简介：燕红（１９７６一），女，黑龙江哈尔滨人，博士，副教授，主要从事环境微生物与生物化学方面的研究．Ｔｅｌ：０４５１　８６３９２７１２；Ｅ—ｍａｉｌ：ｙａｎｈ０ｎｇ２Ｏ４８２１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｅｒｉ．

　浙江大学学报（农业与生命科学版）　第３　７卷　

纤维素和木质素作为一种潜在的可再生资　

源，具有很大的利用空间．但由于纤维素易与半　纤维素、木质素等难分解的物质相结合，故在利　

用纤维素前，必须把它从木质素和半纤维素的　

包裹中释放出来；而半纤维素较木质素易降解，　因此，纤维素的降解关键就在于木质素的降解，　

所以利用微生物降解木质素和纤维素一直受到　人们的重视．我国在２Ｏ世纪９０年代中期开始　

了对白腐真菌的大量研究，尽管其中也包括了　对白腐真菌和木质素降解酶的降解特性、产酶　

条件及酶分子水平上的研究，但是使用的菌种　

多是从国外引进的黄孢原毛平革菌　（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ），而对我国自　

己的菌种却研究得较少，因此，开发我国本土的　优良白腐真菌菌种已成为一种必然的趋势，从　

而使我国在白腐真菌领域摆脱对国外的依赖．　基于此，本文从黑龙江省丰富的自然朽木及土　

壤样品中分离、纯化相关菌株，并分别通过初筛　

和复筛以获得高效降解木质素的真菌菌株．　

１　材料与方法　

１．１　材料　

１．１．１　样本来源　实验所用的腐土和朽木　样品共３１份，均于２００５年１Ｏ月采自黑龙江省　

牡丹江国家森林地质公园．　１．１．２培养基　

１）ＰＤＡ培养基．取土豆２００　ｇ，加入１　Ｌ蒸　

馏水，文火煮３０　ｒａｉｎ，冷却后挤出汁液，在汁液中　加入葡萄糖２０　ｇ，ＫＨ２ＰＯ４　３　ｇ，ＭｇＳＯ４　１．５　ｇ，琼　

脂１５　ｇ和微量ＶＢ　，加热溶解，定容至１　０００　ｍＬ，　

用Ｈ。Ｓ０４或ＮａＯＨ调节ｐＨ值为６．　２）ＧＵ—ＰＤＡ平板培养基．于ＰＤＡ培养基　中加入０．１％的愈创木酚［１］．　

３）液体ＫｉｒＫ培养基口］．基本培养基　

（ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）：ＫＨ２ＰＯ４　０．２　ｇ．Ｌ～，ＭｇＳＯ４．　

７Ｈ　２　Ｏ　０．０５　ｇ・Ｌ＿。，ＣａＣ１２　０．０１　ｇ・Ｌ一，１　ｍＬ无　机溶液，０．５　ｍＬ维生素溶液．　

无机溶液，ｇ．Ｌ　：氨基三乙酸酯１．５，　

ＭｇＳＯ４．７Ｈ　２　Ｏ　３．０，ＭｎＳＯ４　０．５，ＮａＣ１　１．０，　

ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ　０．１，ＣｏＳＯ４　０．１，ＣａＣ１２　０．０８２，　

ＺｎＳＯ４　０．１，ＣｕＳＯ４．５Ｈ　２　Ｏ　０．０１，ＡｌＫ（ＳＯ４）２　０．０１，Ｈ　３ＢＯ３　０．０１，Ｎａ２ＭｏＯ４　０．０１．　维生素溶液，ｍｇ．Ｌ～：生物素２，叶酸２，盐　

酸硫胺素（维生素Ｂ　）５，核黄素（维生素Ｂ。）５，　维生素Ｂ。盐酸盐１０，维生素Ｂ　。０．１，烟酸５，　

ＤＬ一泛酸钙５，对氨基苯甲酸５，硫辛酸５．　氮源：１．２　ｔｏｏ１．Ｌ　酒石酸铵；碳源：１　的　

葡萄糖（５６　ｍｏ１．Ｌ　）；缓冲成分：２Ｏ　ｍｍｏ１．Ｌ　

ＤＭＳ：ｐＨ　４．５．　以上培养基均在１２１℃下灭菌２Ｏ　ｒａｉｎ．　１．１．３试验器材　恒温培养箱、紫外一可见　

分光光度计、恒温水浴锅、超净工作台、高压蒸　

汽灭菌锅、电子分析天平、离心机等．　１．２方　法　１．２．１　菌株分离纯化　分别称取５　ｇ样品　

捣碎后，加入到装有５０　ｍＬ　０．９　生理盐水和　少量玻璃珠并经高压灭菌后的三角瓶中，振荡　

均匀后，进行逐级梯度稀释．取０．１５～０．２　ｍＬ　经适当梯度稀释的样品溶液涂布于ＰＤＡ分离　

平板上，于２８℃培养４～５　ｄ，挑取单一菌落划　

线培养于分离平板上，并通过反复平板划线进　行分离纯化直至获得纯菌株；然后将纯菌株接　

种到ＰＤＡ斜面培养基上，于２８℃下恒温培养　４　ｄ后，放人４℃冰箱保存备用．　

１．２．２　菌株初筛　将已经分离纯化并保存　

于冰箱中的菌株分别接种到ＧＵ—ＰＤＡ培养基　上，并作多个平行，于２８℃恒温培养７　ｄ，观察　

菌落颜色及形状变化；对产生变色圈的菌株分　

别测定其菌落圈和变色圈的直径，并计算其平　均值．　

１．２．３　菌株复筛　从斜面培养基上将初筛　产生变色圈的菌种接种到ＰＤＡ培养基平板　

上，于２８℃恒温培养数天，直到获得大量成熟　

孢子；打下直径ｌ　ｃｍ的菌塞接入装有３０　ｍＬ　ＫｉｒＫ培养基的１５０　ｍＩ　三角瓶中，于２８℃恒　

温静止培养７　ｄ，取样测定发酵液中的酶活力，　平行操作３次，取平均值．　

１．２．４　各种木质素酶活力的测定　

１．２．４．１　粗酶液的制备．发酵液于３　０００　ｒ．　

ｒａｉｎ　下离心１５　ｒａｉｎ后的上清液即为粗酶液．　

１．２．４．２木质素过氧化物酶（ＬｉＰ）活力的测　定．以在Ｈ　Ｏ　存在下氧化Ａｚｕｒｅ　Ｂ染料来表　

示ＬｉＰ的活力．方法为：０．１２５　ｔｏ

ｏ１．Ｌ　柠檬酸　第３期　燕红，等：高效木质素降解菌株的分离筛选　

缓冲液（ｐＨ　３．Ｏ）１　ｍＬ，０．１６０　ｍｍｏ１．Ｌ　Ａｚｕｒｅ　

Ｂ溶液５００／ｚＬ，培养基滤出液５００　Ｌ，在３Ｏ℃　下加入２　ｍｍｏ１．Ｌ　Ｈ２Ｏ２溶液５００　Ｌ启动反　

应，测反应最初３　ｍｉｎ内在６５１　ｎｍ处ＯＤ值的　减小速率．以每ｍｉｎ每ｍＬ培养基滤出液降低　０．１个ＯＤ值为１个酶活力单位Ｅ２－４￣．　

１．２．４．３锰过氧化物酶（ＭｎＰ）活力的测定．　０．０５　ｍｏ１．Ｌ　醋酸缓冲液（ｐＨ　４．５）３．４　ｍＬ，　

１．６　ｍｍｏ１．Ｌ～ＭｎＳＯ４溶液０．１　ｍＬ，０．４　ｍＬ　

培养基滤出液，预热至３７℃后加入１．６　ｍｍｏ１．　Ｌ　Ｈ：Ｏ　溶液０．１　ｍＬ启动反应，测反应最初　

３　ｍｉｎ内在２４０　ｎｍ处的吸光度变化．用每ｍｉｎ　

吸光值增加０．１的酶量来表示１个酶活力　单位　．　

１．２．４．４　漆酶（Ｌａｃ）活性的测定．含０．５　

ｍｍｏ１．Ｌ　ＡＢＴＳ的０．１　ｍｏ１．Ｌ　醋酸缓冲液　（ｐＨ　５．０）２　ｍＬ，加入ｌ　ｍＬ酶液后启动反应，　

测在４２０　ｎｍ处吸光度的变化．用每ｍｉｎ　１　

ｍｏｌ　ＡＢＴＳ被转化所需的酶量来表示１个酶　活力单位ｌ＿６］．　

２　结果与讨论　

２．１菌株的分离纯化　根据菌落形态从３１份样品中共分离纯化　

出１５５株菌，将其接种于试管斜面培养基上，于　

４℃冰箱中保存备用．　２．２菌株的初筛　

在初筛实验中，共有９株菌发生了颜色反　

应，对于白腐菌来说，变色圈的形成有２种方　式．一种是变色圈在菌丝的外圈形成（　／ｄ　＜　

１，ｄ　为菌落直径，ｄ　为变色圈直径），另一种是　变色圈在菌丝的内圈形成（ｄ　／ｄ　＞１）．研究［７］　

表明，ｄ　／ｄ。的比值可作为判定该菌是否选择　

性降解木质素的依据．如果比值小于１，则选择　

性降解木质素；若比值大于１，则纤维素首先被　降解．本实验在第７　ｄ分别对各菌株的菌丝圈　

（菌落圈）直径、变色圈直径及其比值进行测定　的结果（表１）表明：９个菌株都能产生变色圈反　

应，且ｄ　／ｄ　的比值均小于１，初步判断它们都　

能优先降解木质素．无论是以微生物直接用于　生物制浆或生物漂白，还是以微生物发酵产生　适宜的酶制剂用于工业化生产，培养和选育具　有高效降解木质素活力的优秀菌株都是至关重　

要的．利用特定的颜色反应能够判断一个菌株　是否具有木质素降解能力．微生物若分泌木质　

素降解酶，就能与培养基中有效的指示剂发生　反应，产生特异颜色一变色圈ｌ８］，这是筛选木质　

素降解菌的有效方法．但指示剂的选择、培养基　的组成，对该反应所选择出的菌株能否准确反　

映其真正的木质素降解能力有重要影响．有研　究＿ｇ　通过比较众多菌株在不同培养基、不同指　

示剂上的情况，分析各个参试菌株对木质素的　降解程度，得出以愈创木酚为指示剂、桉木粉为　

底物的琼脂培养基产生的变色圈与木质素降解　

能力之间的对应关系最佳．该方法在含有木质　

素底物的平板培养基中接种具有木素降解酶活　

性的菌株，利用木质素降解酶的催化作用使木　质素发生降解反应，可在菌落周围产生变色　

圈ｌ＿５］．由于变色圈面积实际上反映了木素降解　

酶对木质素的降解能力，因此以菌落圈与变色　圈直径比值（　／ｄ　）为判断依据可以评价单位　

菌株分泌木索降解酶的能力，比值越小，说明单　

位菌株可能产生的酶作用能力越强；而该试验　

中１４－１０菌株的ｄ　／ｄ。比值最小，说明该菌株　

可能产生木素降解酶的能力最强．但是该方法　仅是一个定性的检测方法，必须经过酶活力测　

定来进行定量验证．　

表１　菌丝圈（菌落圈）直径、变色圈直径及比值　Ｔａｂｌｅ　１　Ｄｉａｍｅｔｅｒ　ａｎｄ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｃｏｌｏｎｙ　ａｎｄ　ｃｏｌｏｒ—ｚｏｎｅ　ｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ｎｉｎｅ｛ｕｎｇａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｐｌａｔｅｓ　

菌株　编号　１４—１Ｏ　１０—４　１２—５　１６—２　１３—１３　１５—１　１７—３　２１－１１　１４—７　菌　‘菌落圈）　变色圈直径　ｄ　／　２　直径ｄｌ／ｃｍ　ｄ２／ｃｍ　～…　３．４ＯＯ　２．１２５　１．５００　２．５２５　１．１６７　１．９ＯＯ　Ｏ．８５０　０．９５０　２．６５Ｏ　０．５５０　０．８２５　０．７５０　０．５５０　０．８３３　０．６２５　０．６００　０．６７５　０．９００　０．１６２　０．３８８　０．５００　０．２１８　０．７１４　０．３２９　０．７０６　０．７１１　０．３４０　

２．３菌株的复筛　

在菌株的复筛过程中，对９个发生了颜色