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猪亚洲l型口蹄疫免疫抗体检测与分析作者：邵胜勇来源：《畜牧兽医科学》 2018年第4期猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体检测与分析邵胜勇（北京市顺义区动物疫病预防控制中心，北京 101300）摘要：口蹄疫是世界动物卫生组织(OIE)规定的A类烈性动物传染病，我国列为一类动物传染病。
口蹄疫共有7种血清型，亚洲I型是其中一种。
目前，国内还没有对猪亚洲I型口蹄疫进行强制免疫，我们通过2015-2017年对13958头猪进行亚洲I型口蹄疫免疫抗体的检测，旨在对本地区猪群通过免疫口蹄疫O型-亚I型疫苗产生的抗体进行监测，掌握群体免疫抗体水平，评价免疫疫苗的有效性，并对免疫效果进行总结，对生产中发现的问题进行分析，提出解决的对策。
方法为：猪群在免疫口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗28d至4个月之间，免疫次数从一免至五免，采集猪血清，以亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，定量检测样品抗体水品。
通过分析检测数据，得出如下结论：猪亚洲I型口蹄疫免疫抗体阳性率和抗体水平总体不高，但具备较好的保护力；商品猪免疫抗体阳性率和抗体水平均高于种猪；免疫抗体阳性率随免疫次数增加呈逐渐上升趋势，但四免后阳性率下降，到五免时则再次上升。
通过检测免疫抗体，分析其变化特征及规律，为猪亚洲I型口蹄疫的防控、研究及免疫提供依据。
关键词：口蹄疫；亚洲I型；免疫抗体；检测中图分类号：S858.28 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.0021 方法1.1 疫苗疫苗均为口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗，中牧实业股份有限公司兰州生药厂生产。
1.2 疫苗免疫及样品采集由于实际生产中不对猪进行亚洲I型口蹄疫单独免疫，因此免疫程序均按照口蹄疫O型-亚洲I型二价灭活疫苗的免疫程序进行免疫，即仔猪30日龄时首免，1个月后二免，之后每4个月免疫1次。
所检测血清样品均为免疫后28天至4个月以内的样品，免疫次数从一免至五免。
口蹄疫新液相抗体检测试剂盒加样操作说明一、检测10份样本1、如图所示，A1-A10加175ul的洗涤液（1×PBST），A11、A12、B12加100ul的洗涤液（1×PBST），B1-B11、C1-C11、D1-D11、E1-E11、F1-F11、G1-G11、H1-H11加100ul的洗涤液（1×PBST）。
2、A1-A10加25ul的待检血清，A11加100ul的阳性对照，A12加100ul的阴性对照，用排枪吹打混匀（每孔吹打6-7次），待检血清1-10列以100ul的量从A到H连续2倍稀释；阳性对照第11列以100ul的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照第12列以100ul的量从A到B连续2倍稀释。
3、各孔稀释比例为，如图所示：4、转板，从血清稀释板转到包被板的对应孔，每孔50ul。
再加稀释后的病毒抗原，1-11列各加入50ul，A12、B12各加入50ul，E12、F12、G12、H12各加入100ul。
5、加样完毕后，每孔的最终量均为100ul，待检血清、阳性对照、阴性对照的稀释度翻倍，如图所示：二、检测20份样本1、如图所示，A1-A10、E1-E10加175ul的洗涤液（1×PBST），A11、E11、A12、B12加100ul 的洗涤液（1×PBST），B1-B11、C1-C11、D1-D11、F1-F11、G1-G11、H1-H11加100ul的洗涤液（1×PBST）。
2、A1-A10、E1-E10加25ul的待检血清，A11加100ul的阳性对照，A12加100ul的阴性对照，用排枪吹打混匀（每孔吹打6-7次），待检血清1-10列以100ul的量从A到D、从E到H连续2倍稀释；阳性对照第11列以100ul的量从A到H连续2倍稀释；阴性对照第12列以100ul的量从A到B连续2倍稀释。
3、各孔稀释比例为，如图所示：4、转板，从血清稀释板转到包被板的对应孔，每孔50ul。
一、检测方法特异性抗体检测在疫病诊断、传染病流行病学调查及评价疫苗免疫效果评价具有重要的参考意义。
现阶段，抗体检测的方法较多，除传统的沉淀反应，凝集试验，补体结合试验外，标记免疫测定已成为主要的免疫抗体测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，而酶联免疫测定是目前应用最为广泛的方法之一。
1.中和抗体中和抗体是当病原微生物侵入机体时产生的相应的抗体。
病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。
中和抗体是B淋巴细胞产生的某些抗体，中和抗体的作用机制是改变病毒表面构型，阻止病毒吸附于易感细胞，使病毒不能穿入胞内进行增殖；病毒与中和抗体形成的免疫复合物，易被巨噬细胞吞噬清除；有包膜的病毒表面抗原与中和抗体结合后，激活补体，可导致病毒的溶解。
病毒中和试验是世界动物卫生组织推荐的标准方法，抗体与口蹄疫病毒特异性中和作用使病毒失丧失感染力，需要培养病毒敏感细胞；所需的病毒必须为活病毒，具有感染性。
2、结构蛋白抗体在原则上来说，只要是异己蛋白质进入机体，就会被免疫系统识别，然后产生相应抗体。
灭活疫苗的本质是一种抗原，只不过它通过改造已经没有了病毒的毒性。
当疫苗注入到机体之后，由于病毒抗原含有多种不同的蛋白，因此机体会产生不同的抗体。
然而，并非所有的结构抗体都有抗病毒的作用。
中华人民共和国农业农村部规定的口蹄疫免疫抗体评价的方法分别为液相阻断E L I S A抗体检测试验、正向间接血凝试验、V P1结构蛋白抗体检测试验。
2.1液相阻断ELISA抗体检测试验（国际贸易指定法）我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。
目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。
硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。
ELISA的操作与注意事项一、阻断ELISA1、液相阻断ELISA（代表试剂盒：口蹄疫O型、ASIAⅠ型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒：兰州兽医研究所生产）1.1原理：①兔抗口蹄疫血清+病毒抗原（被检血清与病毒抗原反应后病毒抗原剩余）+豚鼠抗口蹄疫血清+兔抗豚鼠酶标结合物+底物显色+终止液+读数（OD值，颜色越深OD值越大）。
颜色的深浅与病毒抗原剩余量成正比，病毒抗原剩余多，则与之反应的被检血清的抗体效价低，反之，病毒抗原剩余少，则与之反应的被检血清的抗体效价高。
因此，随着被检血清的递倍稀释，血清效价逐渐降低，与被检血清反应的病毒抗原剩余逐渐增多，颜色也逐渐加深。
②兔抗口蹄疫血清+被检血清（被检血清与病毒抗原反应后被检血清剩余），则反应终止，以后加入的试剂随着洗板被清洗，最终无颜色反应，则说明被检血清抗体效价高。
因此，反应颜色越浅则抗体效价最高，颜色的深浅也抗体的效价成反比。
1.2 操作过程1.2.1提前一天准备工作：①稀释血清：使用血清稀释板（U型96孔板），常用稀释布局如下图：按图示加入相应量的PBST,吸取12.5ul被检血清和50ul阴、阳性血清于相应孔中，将待检血清和阴、阳性血清做2倍连续稀释，然后再加入50ul的病毒抗原对照，病毒抗原对照孔加入100ul病毒抗原对照，这时，除去空白孔，所有孔均为100ul体系。
用包被缓冲液稀释口蹄疫兔抗血清至工作浓度，将稀释后的口蹄疫兔抗血清加入ELISA板中，每孔加50ul,震荡后使包被液布满整个孔底，封板，在室温条件下过夜。
1.2.2 第二天工作（严格按说明书操作）洗ELISA板→转移血清稀释板上的病毒抗原与血清反应液（按照稀释血清布局图的格式相应的转移至ELISA板上）→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的豚鼠抗血清→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的兔抗豚鼠酶结合物→孵育60分钟→洗ELISA板→加入底物（现加入相应量的H2O2）→孵育15分钟→加终止液→读数→结果判定。
口蹄疫亚洲I型液相阻断ELISA抗体检测试验
一、适用范围：
试剂盒来自中国农业科学院兰州兽医研究所，适用于A型和亚洲I型口蹄疫抗体检测。
二、器材准备：
1．移液器：5-50μl移液器、0.2-10μl移液器、50-200μl移液器、50-300μl移液器各一把。
2．抗原抗体反应板：微量血凝板（U型、V型均可）若干块，用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。
3．水质要求：无离子水或蒸馏水均可。
三、试剂准备：
1．包被缓冲液（PH9.6）
将试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开，将胶囊内粉末小心倒入100ml无离子水中溶解即可。
4℃存放，1月内有效。
2．洗涤液（PBST）
将本试剂盒配备的25倍浓缩PBST液（可能有结晶形成，用时微热溶化）用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。
（如果PH降低，务必用NaOH调制7.4）
3．底物溶液
取1片柠檬酸-磷酸盐片剂（试剂盒配备）溶于100ml无离子水中，溶解后，取50ml 溶液，再加1片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装（5ml/瓶或10ml/瓶），避光-20℃保存。
用前避光溶化，临用时每1ml上述溶液加10μl3%的双氧水（H2O2）。
务必加双氧水！
四、操作步骤：
1．用包被缓冲液稀释亚洲I型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1:1000）,在ELISA 板上每孔加50μl，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。
2．抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应根据不同的需要，选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。
图1 96孔酶标板检测10份样品布局图
A
B
C
D
E
F
G
H
图1为抗体滴度测定（定量）检测10份样品布局图；图2为抗体滴度测定（定量）检测20份样品布局图。
图2 96孔酶标板检测20份样品布局图
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
以图1为例，在U型血凝板上按50μl/孔量用PBST将待检血清从1:4开始做2倍连续稀释至1:512。
同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔加入50μl用PBST稀释到使用浓度的亚洲I型口蹄疫病毒抗原（稀释浓度以试剂盒说明书为准），病毒抗原对照孔加100μl。
振荡混匀，封板，4℃过夜。
加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。
3．用洗涤液（1×PBST）连续洗ELISA板5次，在吸水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔，每孔50μl，封板，37℃温育1小时。
4．同上洗版5次，甩干。
用豚鼠兔抗血清稀释液稀释亚洲I型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），每孔加50μl，封板，37℃温育1小时。
5．同上洗版5次，甩干。
用1×PBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度（1:1000），每孔加50μl，封板，37℃温育1小时。
6．同上洗版5次，每孔加50μl底物溶液（务必加双氧水），37℃温育15分钟。
每孔再加50μl终止液终止反应，立即在492nm波长下读取光吸收值（D492nm值）。
五、结果判定
1．试验认可标准
每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照D492nm值应在1.5±0.5范围内。
阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1:8。
2．血清抗体效价的判定
抗原对照孔是4孔，弃去最高和最低D492nm OD值，计算剩余2孔的平均D492nm值，再除以2，即50%对照值。
该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照D492nm值。
3．结果判定
抗体效价大于或等于1:128，判为口蹄疫亚洲I型抗体阳性；1:64～1:128时，判为可疑；小于1:64，判定为阴性。
可疑血清样品，可以重测，重测抗体效价大于或等于1:128，判为阳性，小于1:128，判为阴性。
4．ELISA抗体效价与免疫动物攻毒保护的关系
牛、羊：抗体效价≥1:128，99%以上保护；效价≤1:16，不保护；效价在1:22～90间，50%保护。
