ELISA原理、方法、操作及注意事项解析

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay, ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

一、ELISA的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

进行检测时，样品中的受检物质（抗原或抗体）与固定的抗体或抗原结合。

通过洗板除去非结合物，再加入酶标记的抗原或抗体，此时，能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。

通过加入与酶反应的底物后显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析。

由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的灵敏度。

二、ELISA的基本类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

这种测定方法中有3种必要的试剂：1. 固相的抗原或抗体；2. 酶标记的抗原或抗体；3. 酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

1. 双抗体夹心法测抗原针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。

适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

2. 竞争法测抗原首先将特异性抗体包被于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，另一组只加酶标记抗原，经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。

此方法测定的抗原只要有一个结合部位即可，对小分子抗原如激素和药物类的测定常用此法。

优点是快，缺点是需要较多量的酶标记抗原。

3. 免疫抑制法测抗原被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原的量成正比，二者之差即为预测抗原的量。

ELISA完整详解(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于4 50nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D 值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。

SOP_13-1 酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理与注意事项一、基本原理1、包被1.1、固相载体的要求（1）、结合抗体或抗原的容量大（2）、抗体或抗原牢固地固定在其表面（3）、不影响免疫反应性（4）、利于反应充分进行（5）、固相方法简便易行，快速经济1.2、固相载体的材料：聚笨乙烯1.3、包被coating将抗原或抗体结合于固相载体。

1.4、封闭blocking用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。

2、反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。

标记酶的要求：(1)、活性高(2)、性质稳定(3)、专一性强(4)、酶催化底物的显色信号易于判断和测量(5)、方法敏感，重复性好，简单易行(6)、酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉常用酶辣根过氧化物酶HRP（ELISA中应用最为广泛的标记用酶）3、洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离。

4、底物显色HRPDH2+H2O2—————→D+2H2OH2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。

供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种。

常用底物：四甲基联苯胺TMB四甲基联苯胺TMB是ELISA中应用最广泛的底物。

TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性。

二、常用方法与原理1、双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似双抗体夹心法应用：乙型肝炎表面抗体3、竞争法（测抗原）方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。

加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）4、竞争法（测抗体）原理：类似检测抗原的竞争法应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测5、间接法方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。

elisa 调零空白孔摘要：1.ELISA原理简介2.调零的重要性3.空白孔的作用4.操作步骤及注意事项5.总结正文：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物学研究的实验技术，通过检测抗原与抗体之间的相互作用来分析样品中特定蛋白质或其他生物分子的含量。

在ELISA实验中，正确地进行调零和设置空白孔至关重要，因为这有助于减少实验误差，并获得更可靠的结果。

一、ELISA原理简介ELISA实验主要分为三个步骤：首先，将抗原或抗体固定在聚合物载体（如酶标板）上；其次，将待检测样品中的抗原或抗体与酶标二抗结合；最后，通过底物显色反应，根据颜色深浅判断待测样品中抗原或抗体的含量。

二、调零的重要性调零是指在ELISA实验中，将未添加待测样品的空白孔的吸光度值归零。

这样做的目的是消除实验过程中仪器和试剂本身的吸光度干扰，确保实验数据的准确性。

调零可以通过扣除背景值或使用自动调零功能来实现。

三、空白孔的作用空白孔在ELISA实验中起到对照作用，用于检测实验过程中可能产生的非特异性吸附和试剂本身的吸光度。

空白孔的设置可以消除实验误差，提高检测结果的可靠性。

通常，空白孔中不添加待测样品，但会加入其他试剂，如酶标液、底物液和终止液，以模拟实际实验条件。

四、操作步骤及注意事项1.在进行ELISA实验前，应充分了解实验原理、试剂盒说明书和实验流程，确保实验操作的准确性。

2.正确设置空白孔，按照实验要求加入相应试剂，注意避免试剂污染和交叉反应。

3.在操作过程中，遵循实验顺序，严格控制每步操作的时间和温度，确保实验条件的一致性。

4.检测空白孔的吸光度值时，应选用合适的波长和光程，以减少误差。

5.分析实验结果时，应将空白孔的吸光度值进行校正，以消除非特异性吸附和试剂本身的影响。

五、总结在ELISA实验中，正确进行调零和设置空白孔是获得可靠实验结果的关键。

通过消除实验过程中的干扰因素，我们可以更准确地检测待测样品中的目标分子含量，为生物学研究提供有力支持。

ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorentAay)的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、��9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05MH9.�短妓嵫伟�被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg ／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0. 1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ "、“-"号表示。

ELISA干货实验原理+实验步骤+注意事项ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。

洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

一、ELISA样本的处理ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制，在收集标本前都必须有一个完整的计划注意事项1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x22、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。

4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。

如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深，7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存二、标本类型01、ELISA的常见标本液体类标本：血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液等培养细胞组织标本02、ELISA标本的保存一般来说，再5天内测定的血清标本可放置于4°C，标本再冰箱中保存时间过长会导致血清IgG聚合，是间接法的试剂本底加深，超过一周测定的需-20°C保存，冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分不均，应充分混匀并避免产生气泡，浑浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。

ELISA‎方法详细过‎程及步骤ELISA‎是酶联接免‎疫吸附剂测‎定( Enzym‎e-Linke‎d Immun‎o sorb‎n ent Assay‎)的简称。

它是继免疫‎荧光和放射‎免疫技术之‎后发展起来‎的一种免疫‎酶技术。

此项技术自‎70年代初‎问世以来，发展十分迅‎速，目前已被广‎泛用于生物‎学和医学科‎学的许多领‎域。

(一) 原理ELISA‎是以免疫学‎反应为基础‎，将抗原、抗体的特异‎性反应与酶‎对底物的高‎效催化作用‎相结合起来‎的一种敏感‎性很高的试‎验技术。

由于抗原、抗体的反应‎在一种固相‎载体──聚苯乙烯微‎量滴定板的‎孔中进行，每加入一种‎试剂孵育后‎，可通过洗涤‎除去多余的‎游离反应物‎，从而保证试‎验结果的特‎异性与稳定‎性。

在实际应用‎中，通过不同的‎设计，具体的方法‎步骤可有多‎种。

即:用于检测抗‎体的间接法‎(图a)、用于检测抗‎原的双抗体‎夹心法(图b)以及用于检‎测小分子抗‎原或半抗原‎的抗原竞争‎法等等。

比较常用的‎是ELIS‎A双抗体夹‎心法及EL‎I SA间接‎法。

(二) 操作步骤方法一用于检测未‎知抗原的双‎抗体夹心法‎:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包‎被缓冲液将‎抗体稀释至‎蛋白质含量‎为1～10μg／ml。

在每个聚苯‎乙烯板的反‎应孔中加0‎.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶‎液，用洗涤缓冲‎液洗3次，每次3分钟‎。

(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释‎的待检样品‎0.1ml于上‎述已包被之‎反应孔中，置37℃孵育1小时‎。

然后洗涤。

(同时做空白‎孔，阴性对照孔‎及阳性对照‎孔)。

3. 加酶标抗体‎：于各反应孔‎中，加入新鲜稀‎释的酶标抗‎体(经滴定后的‎稀释度)0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4. 加底物液显‎色：于各反应孔‎中加入临时‎配制的TM‎B底物溶液‎0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔‎中加入2M‎硫酸0.05ml。

ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度) 0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

elisa实验原理及注意事项：
一、实验原理
1.包被：抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，原因是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反应等免疫活性：
2、标记：抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点：
3、显色：酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。

二、注意事项
1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x2；
2、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融；
3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。

4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色；
5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存；
6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。

如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深；
7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存；。

ELISA实验原理方法仪器流程图和注意事项分析ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），即酶联免疫吸附法，是一种常用的免疫学检测方法。

该方法通过检测抗原与抗体间的特异结合反应来确定样品中特定抗原或抗体的存在与数量。

ELISA技术广泛应用于生物医学和生物化学领域，如病原微生物检测、药物筛选、分子生物学等。

一、ELISA实验的原理方法：1.抗原或抗体的固定：在试验板上的孔中固定特定的抗原或抗体。

这样，待测样品中的特定抗体或抗原与固定的分子结合，形成复合物。

2.特异性抗体或抗原的添加：将待测样品加入试验孔中，特异性的酶标记抗体或抗原与复合物结合形成特异结合。

3.酶标记抗体或抗原的添加：在第二步形成的特异结合物上加入酶标记抗体或抗原，使其与特异结合物再次发生反应。

4.酶标记分子的检测：添加底物，通过底物的转化反应，观察酶标记物的生成并测定其中的酶活性。

底物催化生成的产物含有染色体，可以用光谱仪检测反应的光密度。

5.检测结果的判定：根据光密度的变化来判断待测样品中特定抗体或抗原的含量，常用的方法包括比色法、荧光法和化学发光法等。

二、ELISA实验的仪器：1.酶标仪或光谱仪：用于测定酶标物产生的光密度或荧光信号。

2.孵育箱：提供恒定的温度和湿度条件，进行酶反应过程。

3.洗板机：用于洗涤试验板以去除非特异性结合部分。

4.加液器：用于添加试剂和样品。

5.显微镜：用于观察试验结果。

三、ELISA实验的流程图：1.将特定抗原或抗体固定在试验板上的孔中。

2.加入待测样品，并与固定的抗原或抗体反应。

3.洗涤试验板，去除非特异性结合的物质。

4.加入酶标记抗体或抗原，形成特异结合。

5.洗涤试验板。

6.加入底物，观察酶标物的生成并测定其酶活性。

7.根据底物转化产物的光密度变化，判定待测样品中特定抗体或抗原的含量。

四、ELISA实验的注意事项：1.使用纯净的试剂和无菌的操作条件，以避免实验结果的偏差。

elisa常用方法及其原理Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，广泛应用于生物学和医学研究中。

本文将介绍Elisa的常用方法及其原理。

一、Elisa的基本原理Elisa是一种通过检测抗原-抗体反应来测定物质浓度的方法。

其基本原理是将待测物质（抗原或抗体）固定在固相载体上，然后加入特异性的酶标记二抗，通过酶标记物的催化作用，将待测物质与酶底物反应产生可测定的信号。

Elisa可以根据待测物质的特异性与酶标记物的催化作用来测定物质的浓度。

二、Elisa的常用方法1.直接Elisa法：将待测抗原直接固定在固相载体上，然后加入酶标记的第一抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。

这种方法简单快速，适用于抗原浓度较高的情况。

2.间接Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。

这种方法灵敏度较高，适用于抗原浓度较低的情况。

3.竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的酶标记抗体和待测样品，通过抗原与酶标记抗体的竞争来测定抗原的浓度。

这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。

4.间接竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体和待测样品，通过第一抗体与第二抗体的竞争来测定抗原的浓度。

这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。

三、Elisa的操作步骤1.涂覆：将待测物质（抗原或抗体）溶液加入固相载体上，使其吸附固定在载体表面。

2.阻断：加入适当的阻断剂，防止非特异性结合。

3.第一抗体反应：加入特异性的第一抗体，使其与待测物质发生特异性结合。

4.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。

5.酶标记抗体反应：加入酶标记的第二抗体，使其与第一抗体结合。

6.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的酶标记抗体。

elisa的方法及原理Elisa（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测特定蛋白质、抗体或抗原的分析方法。

它具有高度的敏感性和特异性，被广泛应用于医学、生物学和生物技术领域。

本文将介绍Elisa的原理、步骤和应用。

一、Elisa的原理Elisa基于免疫学原理和酶学反应，通过特异性抗原-抗体反应来检测目标物质的存在与否。

Elisa通常包括以下几个关键步骤：1. 固定抗原：将目标抗原固定在盘或膜上，以便后续的抗体结合反应。

2. 试样添加：将待测样品加入固定抗原的孔中，允许样品中的抗原与已固定的抗原发生结合。

3. 抗原结合：加入特异性的抗体，并使其与待测样品中的抗原结合。

4. 洗涤：通过洗涤剂去除未结合的物质，以减少非特异性反应。

5. 酶标记抗体结合：加入酶标记的抗体，它与待测样品中的抗原结合。

6. 信号发生：加入染色底物，使酶标记的抗体产生一个可测量的信号（如颜色变化）。

7. 信号检测：使用光度计或其他测量仪器测量信号的强度，与标准曲线相比较，确定待测样品中目标物质的浓度。

二、Elisa的步骤Elisa的步骤十分关键，需要严格按照以下程序进行：1. 准备工作：准备所需的试剂和设备，保持实验区域的洁净。

2. 抗原包被：将具有特异性的抗原添加到固相载体（如96孔板或膜）上，制备固定抗原。

3. 样品添加：将待测样品和标准品加入孔中，与固定抗原发生结合。

4. 增强体添加：加入特异性的酶标记抗体，允许其与结合的抗原发生结合。

5. 洗涤：通过洗涤液去除未结合的物质，减少背景干扰。

6. 底物加入：加入染色底物，与酶标记的抗体发生酶学反应。

7. 反应终止：加入终止液，停止酶学反应，保持结果稳定。

8. 信号测量：使用光度计测量发色底物的吸光度，与标准曲线或对照样品进行比较。

三、Elisa的应用Elisa具有广泛的应用领域，以下是一些常见的应用示例：1. 医学诊断：Elisa可用于检测疾病标记物、肿瘤标志物和病原体抗体，用于早期诊断和治疗监测。

ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。

它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。

此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。

(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。

即：用于检测抗体的间接法(图a) 、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二) 操作步骤方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。

在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

(简称洗涤，下同)。

2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。

然后洗涤。

(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。

37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。