B16小鼠黑色素瘤细胞贴壁培养

B16黑素瘤细胞的增殖活性测定
一．实验材料
（一）仪器：倒置显微镜、96孔板（平底板）、微量移液器（枪及枪头）、恒温培养箱、培养平皿、喷壶、封口膜、培养瓶100ml、点滴瓶(250ml、500ml)、烧杯（500ml、50ml）、量筒（500ml，100ml，10ml），滤器及滤膜（0.22um）、酒精灯、移液管、吸球、吸管架及瓶架、镊子、标签贴、双蒸器、超净台、酶标仪、摇床
（二）试剂：胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、PBS液、75%酒精、MTT（四甲基偶氮唑蓝）、DMSO（二甲基亚砜）
二．实验方法
采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）。

取对数期的B16黑素瘤细胞，弃去培养液，用
PBS液清洗2次，加入培养液，调节细胞浓度为0.5×104
—1×10
4
/孔相当于干细胞悬液5
×104
—10×10
4
个（ml
-1
）,加入96孔板中，每孔加入100ul。

于37摄氏度5%CO2恒温培养
箱中培养，至细胞单层铺满孔底（大概20h左右），吸去培养液，加入等体积不同浓度的药物培养基，每个浓度组设置5个复孔，并设置对照组（细胞+培养基）和空白对照组（培养
基），培养基中均含5%胎牛血清，于37摄氏度5%CO2恒温培养箱中培养56h，于56时前20min
每孔加入20ul MTT（5mg/ml）液，继续培养4h，吸去培养液。

加入二甲基亚砜（DMSO）150ul/孔，摇床震荡10min.置于酶标仪上在波长490nm处测各孔吸光度A，以A表示细胞的增殖。

（计算细胞增殖率，细胞增值率=（A含药组-A空白组）/(A对照组-A空白组)×100%）。

黑色素细胞培养方法黑色素细胞是一类具有黑色素合成能力的细胞，主要存在于皮肤、眼睛和内耳等组织中。

研究黑色素细胞在生理和病理过程中的作用对于了解皮肤色素变化、黑色素瘤的发生机制以及开发相关药物具有重要意义。

因此，黑色素细胞的培养方法成为研究人员关注的焦点之一。

一、黑色素细胞的来源黑色素细胞可以来源于多个渠道，主要包括：1. 人体组织中的黑色素细胞：从人体皮肤、眼睛以及其他含有黑色素细胞的组织中获取。

2. 原代培养：从新鲜组织中分离黑色素细胞，进行原代培养，获得纯化的黑色素细胞。

3. 细胞系：已建立的黑色素细胞细胞系，如SK-MEL-28、A375等。

二、黑色素细胞的培养基选择黑色素细胞的培养基应当提供适宜的营养物质和环境条件，以维持细胞的正常生长和功能表达。

常用的黑色素细胞培养基成分包括：1. 基础培养基：如DMEM、MEM等，提供细胞生长所需的营养物质和能量。

2. 补充物质：如胎牛血清、细胞生长因子等，可以促进细胞增殖和分化。

3. 抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细菌和真菌污染。

三、黑色素细胞的分离与培养1. 组织分离：从人体组织中分离黑色素细胞的方法有多种，如酶消化法、机械分离法等。

其中，酶消化法是常用的黑色素细胞分离方法，通过酶的作用，将组织中的细胞分散为单细胞悬浮液。

2. 细胞培养：将分离得到的黑色素细胞接种于预先制备好的培养基中，放置于恒温培养箱中，提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等条件进行培养。

初始培养过程中，可以添加生长因子和血清等促进细胞增殖和分化。

四、黑色素细胞的鉴定与纯化1. 形态学鉴定：利用显微镜观察黑色素细胞的形态特征，如细胞形状、大小、色素颗粒分布等。

2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术检测黑色素细胞特异性标记物，如Melan-A、TYR等。

3. 流式细胞术：利用流式细胞仪检测黑色素细胞表面标记物的表达情况，如CD117、CD166等。

4. 纯化方法：通过细胞培养和细胞分选技术，如细胞贴壁法、免疫磁珠法等，可获得纯化的黑色素细胞。

一、实验目的1. 掌握细胞贴壁生长的基本原理和方法。

2. 了解细胞培养过程中细胞贴壁生长的重要性。

3. 观察细胞在不同条件下的贴壁生长情况，分析影响细胞贴壁生长的因素。

二、实验原理细胞贴壁生长是细胞在体外培养过程中的一种重要生长方式。

细胞在培养皿表面贴附，通过细胞与培养皿表面的相互作用，细胞逐渐伸展、增殖。

细胞贴壁生长对于细胞培养、细胞实验和药物筛选等具有重要意义。

三、实验材料1. 细胞：小鼠心肌细胞（HL-1细胞）2. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清3. 培养工具：培养皿、移液枪、吸球、无菌操作台、显微镜、盖玻片、载玻片4. 实验试剂：0.5%多聚赖氨酸、PBS缓冲液、胰蛋白酶四、实验步骤1. 预处理：将细胞从培养瓶中取出，用胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液清洗细胞，收集细胞悬液。

2. 细胞贴壁：将细胞悬液加入培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

3. 贴壁条件优化：1）将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟，自然晾干后，将其放置于培养皿底部。

2）将细胞悬液加入盖玻片上，使其均匀铺展。

3）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

4. 观察与记录：1）每隔一定时间（如1小时、2小时、4小时等），在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。

2）记录细胞贴壁生长速度、细胞形态、细胞数量等指标。

5. 数据分析：1）根据观察结果，绘制细胞贴壁生长曲线。

2）分析影响细胞贴壁生长的因素，如培养时间、细胞密度、培养条件等。

五、实验结果与分析1. 细胞贴壁生长曲线：细胞在培养皿中贴壁生长，随着时间的推移，细胞数量逐渐增加，细胞形态逐渐伸展。

2. 影响细胞贴壁生长的因素：1）培养时间：细胞贴壁生长速度随培养时间的延长而增加，但过长的培养时间会导致细胞密度过大，影响细胞生长。

2）细胞密度：细胞密度越高，细胞贴壁生长速度越快，但过高的细胞密度会导致细胞相互挤压，影响细胞生长。

3）培养条件：适当的温度、pH值、气体环境等有利于细胞贴壁生长。

营养物失衡是维持癌细胞恶性生长的因素之一--DMEM培养基使黑色素瘤B16细胞的恶性生长抑制吴江涛【期刊名称】《烟台大学学报（自然科学与工程版）》【年(卷),期】2002(015)001【摘要】对小鼠黑色素瘤B16细胞在DMEM和RPMI1640两种培养基中培养产生的活细胞数和黑色素量进行了检测.结果显示,该癌细胞在DMEM培养基中培养产生的活细胞数比在RPMI1640培养基中培养产生的活细胞数平均减少87.9%,而黑色素量平均增加795%.以"黑色素量/活细胞数"计算分化指数,再以"DMEM中的分化指数/1640中的分化指数"计算DMEM相对于1640的对B16细胞的分化指数,显示DMEM中的分化指数平均是1640中的分化指数的67.8倍.提出营养物失衡是维持癌细胞恶性生长的因素之一.【总页数】7页(P35-41)【作者】吴江涛【作者单位】烟台大学,生物化学系,山东,烟台,264005【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.Bcl-2抑制剂S1通过内质网途径对小鼠黑色素瘤B16细胞移植瘤生长抑制作用[J], 李亚平;吴瑶;颜晓羽;薛亚楠;路圣垚;苏静2.三氧化二砷抑制恶性黑色素瘤B16细胞生长及对端粒酶活性的影响 [J], 王丽;陈治文;夏俊3.口腔恶性黑色素瘤中血管内皮生长因子和一氧化氮合酶的表达与癌细胞增殖的关系 [J], 李晓光;王延秀;任绪华;李毅;杨宪勇;侯刚;王青4.高聚金葡素对非小细胞肺癌细胞株A549的生长抑制及其治疗恶性胸腔积液的效果观察 [J], 柯军;葛海燕5.RPMI-1640和DMEM培养基中肝癌细胞系BEL-7402与HepG-2的生长状态比较 [J], 赵翔;张沙;肖军军;林明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黑色素瘤小鼠高转移模型体内筛选和细胞系的建立的开题报告I. 研究背景和意义黑色素瘤是一种高度恶性的恶性肿瘤，具有高度侵袭性和转移性。

由于黑色素瘤缺乏有效的治疗手段，其治疗效果非常有限，因此对于黑色素瘤的研究尤为重要。

针对黑色素瘤的研究目前主要采用小鼠高转移模型及其细胞系建立。

小鼠高转移模型是一种重要的研究工具，在筛选治疗药物、探究黑色素瘤转移机制等方面具有重要的意义。

本研究旨在建立一个稳定的小鼠黑色素瘤高转移模型及其细胞系，并通过体内筛选方法寻找针对黑色素瘤的有效药物。

II. 研究内容和方法1. 建立小鼠黑色素瘤高转移模型选用B16-F10小鼠黑色素瘤细胞株，将细胞注射至小鼠的血液循环系统中，待细胞成功转移至小鼠肺部后，取出肺部肿瘤组织建立小鼠黑色素瘤高转移模型。

2. 建立小鼠黑色素瘤细胞系取出小鼠黑色素瘤高转移模型的肿瘤组织进行单细胞悬浮液培养，筛选出稳定的小鼠黑色素瘤细胞系。

3. 体内药物筛选将建立的小鼠黑色素瘤高转移模型分为实验组和对照组，实验组分别注射不同浓度的药物，观察肺部转移情况和肿瘤大小。

III. 预期结果1. 成功建立小鼠黑色素瘤高转移模型并建立稳定的小鼠黑色素瘤细胞系。

2. 体内药物筛选结果，筛选出对黑色素瘤具有有效抑制作用的药物。

3. 对黑色素瘤转移机制进行探究，提供治疗黑色素瘤的新思路和新方案。

IV. 研究意义和价值1. 建立小鼠黑色素瘤高转移模型及其细胞系，为开展黑色素瘤的基础和应用研究提供重要的研究工具。

2. 体内药物筛选，为发现治疗黑色素瘤有效药物提供了新方法和思路。

3. 探究黑色素瘤转移机制，为黑色素瘤的发生、发展和转移提供新认识和新理解。

几种复配美白剂的美白功效研究文/罗婷婷 孙祥灵 赵昆 段国梅 李土桂 何秋星本文通过对7种不同美白剂原料进行复配研究，采用单因素试验、正交试验以及综合评价，优选最佳美白复配组合，通过B16细胞试验评价美白复配组合的美白功效，以此探讨美白复配原料对皮肤色素沉着的改善作用，旨在为今后美白复配化妆品的开发提供依据。

关键词美白剂；复配；黑色素瘤细胞中国素有“一白遮三丑”的审美观念，追求“肤如雪，凝如脂”历来是中国女性关注的热点话题。

目前，大多数美白剂的美白作用机制主要通过抑制酪氨酸酶活性、阻断黑色素合成过程、加速黑色素角质细胞脱落、抑制黑色素向角质细胞迁移、清除自由基等方面来改善皮肤黑色素沉着、肤色暗沉等问题[1-2]。

因此，美白型护肤品在化妆品领域的研究中具有较为广阔的市场和发展潜力。

实验部分01试剂与仪器烟酰胺、熊果苷、维生素C、凝血酸、光甘草啶、谷胱甘肽、白藜芦醇，广州品赫生物技术有限公司；FeSO4、水杨酸，天津市福晨化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷，上海润捷化学试剂有限公司；DPPH、邻苯三酚、酪氨酸酶，上海宝曼生物科技有限公司；B16小鼠黑色素瘤细胞株，北京北纳创联生物技术研究院；DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清，美国Gbico公司；DMSO、MTT、TritonX-100，美国MP Biomedicals公司。

UV-2600，CH紫外分光光度计，岛津公司；SC-3610低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；二氧化碳细胞培养箱，上海圣科仪器设备有限公司；Infinite M200 PRO酶标仪，帝肯贸易有限公司。

02实验方法2.1 单因素试验将维生素C(0.10、0.12、0.14、0.16、0.18mg/mL)、白藜芦醇(0.04、0.08、0.12、0.15、0.20mg/mL)、谷胱甘肽(0.03、0.05、0.08、0.10、0.12mg/mL)、光甘草叮(0.05、0.08、0.10、0.12、0.15mg/mL)、凝血酸(0.02、0.05、0.08、0.12、0.14mg/ mL)、熊果苷(0.25、0.30、0.35、0.40、0.45mg/mL)和烟酰胺(0.14、0.16、0.18、0.20、0.25mg/mL)分别以DPPH 自由基清除率为指标，考察7种美白原料的浓度对DPPH 自由基的抗氧化作用，根据其结果筛选出对DPPH自由基清除效果最好的3种美白原料，其为组合1。

开口箭皂苷抗黑色素瘤侵袭与转移作用研究袁华兵;林平发;陶晓军【摘要】目的研究开口箭皂苷对B16-BL6黑色素瘤肺转移和体外肿瘤细胞穿透人工基底膜的影响.方法小鼠爪下制备黑色素瘤模型,注射不同剂量开口箭皂苷溶液,3周后称量患肢质量并计算肿瘤抑制率,5周后测定小鼠肺、脾、胸腺组织表面肿瘤节结数,Transwell小室实验测定药物对肿瘤细胞侵袭基底膜的影响.结果开口箭皂苷呈剂量依赖性地抑制小鼠黑色素瘤生长,高剂量(45 mg·kg-1)开口箭皂苷可明显减少小鼠肺转移结节数、总转移结节数和转移率(P＜0.05);Transwell小室实验中,开口箭皂苷可显著抑制侵袭细胞数(P＜0.05),抑制率21.46%.结论开口箭皂苷可能通过抑制黑色素瘤生长、转移及降低基底膜侵袭而发挥抗肿瘤作用.【期刊名称】《医药导报》【年(卷),期】2013(032)008【总页数】3页(P1018-1020)【关键词】开口箭皂苷;黑色素瘤;抗肿瘤药【作者】袁华兵;林平发;陶晓军【作者单位】湖北省天门市第一人民医院药剂科,天门,431700;华中科技大学同济医学院药理系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院药理系,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】R286;R965开口箭系百合科Liliaceae铃兰族开口箭属植物，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛等症[1-2]，含有甾体皂苷和甾体皂苷元，具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛生物活性，近年来受到关注[3-4]。

研究证实，开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性[5]，但关于开口箭的抗肿瘤转移和侵袭研究笔者尚未见报道。

黑色素瘤是常见恶性肿瘤，恶性程度高，又称恶性黑瘤，大多原发于皮肤，也可起源于眼、鼻腔等处，早期可发生转移，转移部位多见于肺、脑[6]。

预防黑色素瘤的早期转移是治疗该病的重要方向。

小鼠黑色素瘤自发性转移模型是将高转移能力的B16-BL6细胞种植于动物局部，瘤体增殖生长后，侵袭周围正常组织和血管，进入血循环，到达远处部位发生肿瘤转移[7]。

茶叶提取物EGCG和GCG及ECG对B16细胞内黑色素生成的抑制作用张向娜;林勇;黄建安;刘仲华;梁丹丹【摘要】Inhibitory effects of tea extracts EGCG, GCG and ECG on melanoma cell B16 from mouse were studied in this paper. Cells were treated with different concentrations of GCG, ECG, EGCG and Arbutin, and their morphology was observed in an inverted microscope. The proliferation rate of B16 was determined using MTT method, tyrosinase activity was detected by using L-DOPA as substrate, and NaOH-lysis approach was employed to measure the melanin synthesis. The results showed that EGCG, ECG, GCG could significantly inhibit the melanogenesis and tyrosinase activity in cells B16 with a dose-dependent manner. The proliferation rate would be lower than 50% when the concentration was increased to 60 μg/mL. Compared with the control group, tyrosinase activities affected by the three substances were reduced by 26.67%, 27.27% and 32.71%, respectively, the melanin inhibition rates were all above 30%.In conclusion, tea extracts could efficiently inhibit melanogenesis. The inhibitory effect of GCG was best, followed by ECG, EGCG, and arbutin in turn.%为研究茶叶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechingallate,GCG)和表儿茶素没食子酸酯(epicatechingallate,ECG)对体外培养B16小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影响,分别用不同浓度的EGCG、GCG、ECG和熊果苷(Arbutin,AR)处理细胞,观察效应物对细胞形态的影响,用溴化二苯四偶氮法(MTT法)测定茶叶提取物对细胞增殖率的影响,以左旋多巴(L-DOPA)为底物,测定细胞内酪氨酸酶的活性,采用氢氧化钠裂解法测定细胞内黑色素的含量.结果显示,EGCG、ECG、GCG能显著抑制B16细胞的黑色素生成和酪氨酸酶的活性,且呈剂量依赖关系;当浓度为60μg/mL时,细胞增殖率均低于50%,酪氨酸酶活性与对照组相比分别降低了26.67%、27.27%和32.71%,黑色素生成抑制率均在30%以上.结果表明,茶叶提取物能通过多种途径抑制黑色素生成,且GCG的作用效果最优,ECG的作用效果次之,三者的作用效果均优于熊果苷的作用效果.【期刊名称】《湖南农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(043)004【总页数】6页(P405-410)【关键词】茶叶提取物;表没食子儿茶素没食子酸酯;没食子儿茶素没食子酸酯;表儿茶素没食子酸酯;B16黑色素瘤细胞;黑色素生成;酪氨酸酶【作者】张向娜;林勇;黄建安;刘仲华;梁丹丹【作者单位】国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】Q946.84+1健康、白皙的肌肤是东方女性理想的肌肤状态，而皮肤黑色素的含量及分布很大程度上影响着肌肤的呈色。