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2)实验手段(1)细胞培养及建立泡沫细胞模型将THP-1细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于370C, 5} CO:培养箱静置培养。
该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，倍增时间大约在26 h后。
细胞浓度控制在106/mL，每两天换液一次，每四天传代一次。
细胞复苏后，传至3 }= 5代后方可用于建模。
(2)建立巨噬细胞模型取对数生长期的细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为106/mL，接种于6孔培养板，每孔2 mL。
正常组在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养。
模型组先置于含160 nmol/L PMA的RPMI 1640基础培养液中培养72 h，贴壁后轻轻吸去上清液，PBS洗3遍，更换10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，即得巨噬细胞。
巨噬细胞的鉴定己在发表文献中完成。
(3)建立巨噬源性泡沫细胞模型将获得的巨噬细胞更换含3%胎牛血清的RPMI 1640培养液，并加入终浓度为80 mg/L的Ox-LDL，共同孵育48 h，油红。
染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，即得泡沫细胞模型，此过程即为泡沫化。
(4)针对CaSR的si RNA的构建及转染根据公认的si RNA设计原则(Nat Biotech 2004; 22: 326-330)设计针对CaSR的3 条siRNA，选用验证后效果最好的一条。
同时合成阳性对照和阴性对照。
转染试剂选用Invitrogen公司生产的LipofectamineTM RNAiMAX Transfection ReagentosiRNA目标序列的选取原则:工从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找‘`AA'’二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
注意:GC含量在4_5 070-_5 _5%左右的siRNA 要比那些GC含量偏高的更为有效;在设计siRNA时不要针对_5’和3’端的非编码区Cuntranslated regions UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。
仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。
1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
动物钙离子成像技术具体步骤及方法钙离子成像技术是通过钙离子荧光探针将外源性荧光信号和生理现象耦合起来，通过荧光染料信号的改变反映细胞内游离钙离子浓度，以表征细胞状态的一种技术。
为什么要检测钙离子信号？钙离子是哺乳动物神经元中必需的细胞内信使，在静息状态下，大多数神经元的胞内钙离子浓度大约为50~100nM，其在电活动期间可瞬时升高10~100倍。
钙离子作为细胞内的信号可触发响应，例如改变基因的表达和突触囊泡中神经递质的释放。
由于细胞内有离子泵在各种信号刺激下选择性地运输这些离子，胞内钙浓度是高度动态的。
钙成像技术利用钙离子流的优势和特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针（钙离子指示剂，calcium indicator），在活神经细胞上直接可视化钙信号，从而达到监测神经元活动的目的，已被广泛应用于神经系统方面的研究。
基本原理目前，使用较多的钙离子指示剂主要包括化学荧光指示剂和荧光蛋白指示剂两大类。
荧光蛋白钙指示剂，又称为遗传编码钙指示剂（genetically encoded calcium indicators，GECIs），可分为两种类型，对于FRET-based GECI，当环境中不存在钙离子时，在440nm 的激发波长下，ECFP产生蓝色荧光，Venus不产生荧光；而当存在钙离子时，钙离子与钙调蛋白CaM结合，在440nm激发波长下ECFP发生能量共振转移至Venus，最终产生黄色荧光；对于Single-fluorophore GECI，在钙的存在下，钙调蛋白-M13相互作用引起荧光团环境中的构象变化，导致荧光发射增加。
目前常用的荧光蛋白指示剂有Cameleons、TN-XXL、GCaMP、Pericams和Camgaroo等。
GCaMP系列蛋白（Single-fluorophore）特别是GCaMP6系列蛋白是最主要的钙离子指示剂，且越来越多地被用于体内钙成像研究。
GCaMP6比GCaMP3强10倍，动力学快2倍。
fluo-3 am荧光原理Fluo-3 AM荧光原理荧光染料广泛应用于生物学研究和医学诊断中，其中一种常用的荧光染料是Fluo-3 AM。
Fluo-3 AM是一种可逆的低亲水性荧光钙指示剂，具有较高的荧光量子产率和良好的细胞渗透性，被广泛用于研究细胞内钙离子浓度的变化。
Fluo-3 AM的工作原理是基于荧光共振能量转移（FRET）的现象。
FRET是一种非辐射能量转移过程，其中一个荧光物质的激发态能量被传递给另一个荧光物质的基态。
在Fluo-3 AM中，荧光共振能量转移发生在Fluo-3分子和细胞内游离钙离子之间。
Fluo-3 AM的使用需要一系列步骤。
首先，将Fluo-3 AM溶解在有机溶剂中，得到一个可以渗透细胞膜的荧光染料。
然后，将该溶液加入到含有待测细胞的培养基中，使其与细胞接触。
Fluo-3 AM分子会通过细胞膜渗透进入细胞内，然后在细胞内被酯酶水解，释放出Fluo-3。
Fluo-3是一种钙离子螯合剂，可以与细胞内游离钙离子结合形成复合物。
当Fluo-3与游离钙离子结合时，它的荧光特性会发生改变。
Fluo-3在低钙离子浓度下几乎不发出荧光，而在高钙离子浓度下，其荧光强度会显著增加。
这是因为Fluo-3与钙离子结合后，发生了荧光共振能量转移。
当钙离子浓度较低时，Fluo-3分子间的荧光共振能量转移较弱，荧光信号较低；而当钙离子浓度较高时，荧光共振能量转移增强，荧光信号增强。
为了观察Fluo-3的荧光信号变化，需要使用荧光显微镜进行观察。
在荧光显微镜下，通过激发Fluo-3产生荧光，然后使用适当的滤光片选择荧光信号的波长范围。
Fluo-3的荧光信号可以通过摄像机捕捉到，并通过计算机软件进行图像分析和图像处理。
Fluo-3 AM荧光原理的应用非常广泛。
研究者可以利用Fluo-3 AM 来研究细胞内钙离子浓度的变化，从而了解钙离子在生物体内的重要作用。
钙离子是许多细胞信号传导过程的重要组成部分，包括细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化等。
第３５卷第５期第５７０页 ２００６年１０月 华中科技大学学报（医学版）
Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｈｕａｚｈｏｎｇ ＶｏＩ．３５ Ｎｏ．５ Ｐ．５７０
Ｏｃｔ． ２００６
ｈｉ？一ＣＧＲＰ预孵育对Ｈ２ Ｏ２致心肌细胞内 游离钙离子浓度增加的影响 ＊
汤 强 胡本容 谭 艳 马 嵘 付 琴 陈建国 向继洲△ 华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，武汉４３００３０ 摘要 目的研究人降钙素基因相关肽（ｈＩ３－ＣＧＲＰ）预孵育对过氧化氢（Ｈ ｚＯｚ）致培养乳鼠心室肌细胞内游离钙离 子浓度增加的影响。方法 采用离子荧光数字成像技术，分别测定在有钙和无钙环境中细胞内游离钙离子浓度 （［－Ｃａｚ＋］．）。结果Ｈ ０ （Ｏ，３、０，５、１，０ ｍｍｏ／Ｌ）于１０ ｍｉｎ内呈浓度依赖性地引起细胞内游离钙离子浓度的增加（Ｐ＜ ０．０１），但在有钙或无钙条件下增加幅度的差异无显著性意义（Ｐ＞Ｏ，０５）。ｈＩ３－ＣＧＲＰ（１、１０、１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）预孵育对静息状 态细胞内钙离子浓度无明显影响（Ｐ＞Ｏ，０５）。但能够呈剂量依赖性使Ｈ ０ 引起的细胞内游离钙离子浓度的增加幅度降 低（Ｐ＜Ｏ．０５），且在有钙环境和无钙环境中，其抑制作用差异无显著性意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。结论ｈＩ３－ＣＧＲＰ预孵育能抑制 Ｈ Ｏ 引起的细胞内钙的增加，这可能与抑制胞内钙库的释放有关。 关键词 降钙素基因相关肽； 过氧化氢； 细胞内钙 中图法分类号Ｒ９７２，４
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｒｅ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈ［Ｊ－ＣＧＲＰ ｏｎ Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｒｅｅ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｈ２ ０２ ｉｎ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｃｅｌｌｓ
Ｔａｎｇ Ｑｉａｎｇ，Ｈｕ Ｂｅｎｒｏｎｇ，Ｔａｎ Ｙａｎ ｅｔ ａｌ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｎｇｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００３０
细胞内外钙浓度的调节及意义[日期：2007-12-13] 来源：桂林中学校园网作者：毛敏[字体：大中小]摘要：在正常生理状态下，细胞膜内外钙浓度相差高达1万倍左右。
维持如此大的浓度梯度，主要靠细胞膜对Ca2+极低的通透性、钙亲合蛋白的缓冲以及依赖质膜两侧钙泵，Na+-Ca2+交换系统将Ca2+主动排除，或通过细胞内Ca2+库摄取于贮存Ca2+。
细胞内游离钙离子浓度的升高可能触发肌肉收缩、递质释放、激素分泌等生理过程，甚至引起细胞死亡，神经细胞老化等。
关键词：细胞钙离子钙泵正常细胞中，细胞膜内游离的Ca2+浓度约为0•.1umol/L~1.0umol/L,细胞外钙离子浓度比细胞内钙离子浓度高1 万倍，约为1.5 m mol/L。
一、细胞内Ca2+浓度调节机理细胞膜构成了Ca2+流动的屏障，同时也是细胞功能调节的基础。
正常细胞中。
膜内Ca2浓度比膜外Ca2+浓度低1万倍左右，这并不等于说细胞内缺少Ca2+，事实上某些细胞器，如：线粒体、内质网和突轴小泡能摄取和贮存Ca2+，其中线粒体是细胞内最重要的钙库之一。
另外，细胞内还有一些钙结合到带负电的脂和蛋白上，当细胞受刺激时，细胞外及细胞器中的Ca2+都可能被动的进入细胞质，使游离钙浓度升至1~10 umol/L，从而引起一定的生理反应。
细胞内Ca2+浓度升高，主要由于Ca2+按浓度梯度通过Ca2+通道进入细胞的结果。
膜系统上的Ca2+通道可以是电压依赖的，也可以是激动剂依赖的，前者主要在肌肉和神经细胞中起作用。
电压依赖的钙通道常有三种类型：L-型，长程型：需要较强的去激化刺激才能开放，失活也慢；T-型，瞬时型：较弱的去激化电压即能使通道开放，但失活也快；N-型，需要较强的去激化电压，失活快。
此外，神经元细胞上还存在一种P-型钙通道，需要较强电压激活，失活也慢。
激动剂依赖型的钙通道，也称受体操纵性钙通道，主要通过激动剂与质膜上特点受体结合后，启动通道开放，使细胞外钙进入细胞内，或使细胞器钙库释放，使细胞内游离Ca2+上升。
细胞内钙离子的研究进展细胞内钙离子的研究进展【摘要】钙离子对细胞的功能起着至关重要的作用，因此研究细胞内钙离子有非常重要的意义。
现从细胞内钙离子的生理作用，检测方法，以及与细胞内钙离子相关疾病作一综述。
【关键词】钙离子文章编号：1004-7484（2013）-02-0569-02钙在维持细胞结构和功能起着重要作用。
钙在体内有两种形式：结合状态和离子状态（钙离子），钙离子又分为细胞内钙离子和细胞外钙离子。
正常情况下，细胞外液钙离子的浓度约为10-3mmol/L，细胞内钙离子浓度为10-7mmol/L，二者之间保持动态平衡。
当这种平衡被打破以后，将会出现细胞的损伤和疾病。
1 细胞内钙离子的生理作用1.1 钙离子在肌肉―兴奋收缩偶联中的作用在神经―肌肉接头处兴奋传递的关键是钙离子的内流。
在肌肉―兴奋收缩偶联中，当肌细胞质内钙离子升高，肌肉收缩；当胞质内的钙离子降低，肌肉舒张。
因此胞质内钙离子浓度的升高和降低是引起肌肉收缩和舒张过程的关键。
1.2 钙离子作为第二信使的作用当某些受体与配体结合后，可将二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2），分解为三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），IP3与内质网或肌质网膜上的受体结合引起钙离子释放，然后钙离子与胞质中的钙调蛋白（CaM）结合，生成4Ca2+.CaM复合物，进而发挥各种生理作用。
1.3 钙离子调节神经递质的释放当神经纤维传来动作电位，到达末梢，使突触前膜去极化，钙离子内流，是末梢内钙离子浓度升高，钙离子可启动突出小泡的出胞机制，从而使乙酰胆碱释放突触间隙。
2 细胞内钙离子的检测方法2.1 钙离子选择性微电极测定法钙离子选择性微电极是一种电化学敏感器。
它是利用内充液和组织或细胞之间产生电位差，理想情况下，该电位差是钙离子对数的线性函数，遵循Nernst方程。
该方法的优点：不需使用指示剂。
缺点：穿刺损伤细胞可引起渗漏。
2.2 钙离子活化的荧光蛋白60年代从水母体内发现钙结合发光蛋白，Aequorin是应用最广泛的发光蛋白，它与钙离子结合后，释放氧分子，氧化coelenterazine发出波长465nm的蓝色荧光。
TUNEL 技术, 即脱氧核苷酸末端转移酶( Term inal2deoxynucleo t idyl t ran sferase, TdT )介导的x2dU TP 缺口末端标记(TdT 2m ediatedx2dU TP n ick end labeling, TUN EL ) 技术, 是目前原位检测细胞凋亡最敏感、快速、特异的新方法, 已广泛用于生物、医学研究领域。
TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法.细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA会碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生,所以可以传达细胞凋亡的讯息.TdT为terminal deoxynucleotidyl transferase,此种酵素可以在没有DNA模板的情形下,连结核甘酸到DNA的3'-OH处.1992年,以色列科学家Gavrieli等人将TdT引为为标定DNA片段的一个酵素,自此衍生出TUNEL此项技术.TUNEL的好处是可以在细胞凋亡发生的早期,即可侦测到DNA片段的产生,并且可以直接使用在组织切片上,观察细胞凋亡发生的位置.所以TUNEL目前为广泛接受与使用的一种细胞凋亡的分析方法.阿霉素是蒽环类广谱抗肿瘤的抗菌素,在肿瘤联合化疗中占重要地位,有效率达20～40％。
具有一种蒽环类所特有的并且较为重要的心脏毒性,包括早期毒性和后期影响NF-kB、TNF-a在心肌细胞的表达水平进行半定量分析;比色法测定培养液中乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的活性阿霉素作用于鼠心肌细胞,导致心肌细胞TLR4过度表达,激活其下游信号转导系统,表达细胞因子TNF-a,是其心肌细胞损伤的机制之一;干预阿霉素心肌细胞TLR4及其下游信号转导NF-kB、TNF-a的过度表达,具有一定的心肌保护的作用,按12 mg/kg的ADR总剂量,以每周3次,共两周,每次2mg/kg腹腔注射方式给药,7周后大鼠心脏产生明显功能及形态学异常,可成功建立ADR心肌损伤大鼠模型阿霉素(adriamycin,ADR)是一种广谱高效的葸醌类抗癌抗生素,长期使用阿霉素治疗可导致伴有充血性心力衰竭的扩张性心肌病,多数学者认为ADR心肌毒性的发生与其体内代谢中产生的自由基氧化损伤密切相关阿霉素对实验兔心功能及心肌细胞内游离钙浓度的影响黄先玫康曼丽【摘要】：目的探讨阿霉素慢性心功能损伤的病理生理机制。
黄芩药理作用的研究（南京中医药大学药学院）摘要黄芩的有效成分主要是黄酮类化合物，这些成分具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、清除自由基、免疫调节以及对缺血性再灌注损伤等药理作用。
关键词：黄芩；药理作用；作用机制研究Pharmacological advances in study on Scutellaria （College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine）Abstract：The mainly active ingredient of Scutellaria are flavonoids.These ingredients have antipyretic,antiinflammatory,antibacterial,antiviral,antitumor,scavenging free radicals,immune regulation and ischemic reperfusion injury and other pharmacological effects.Key word：Scutellaria;Pharmacological effects;Mechanism of action黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科多年生草本植物。
其主根肥厚，断面黄绿色。
茎基部多分枝。
叶披针形至条状披针形，下面具多数下陷的腺点。
总状花序顶生；二强雄蕊。
小坚果卵球形。
分布于我国北方地区。
生长在向阳山坡、草原。
其干燥根（药材名：黄芩）为清热燥湿药，性寒、味苦，归肺、脾、肝、胆、大肠、小肠经，能清热燥湿，泻火解毒，安胎。
临床上广泛用于肺热、肠炎痢疾、黄疸及化脓性感染等症。
一.主要成分经研究证实，黄芩有效成分主要是黄酮类化合物，包括黄芩苷元( baicalein) 、黄芩苷( baicalin) 、千层纸素( oroxylin － A) 、千层纸素A －7 －O －葡萄糖醛酸苷( oroxylin － A －7 －O －glucu-ronide) 、白杨黄素( chrysin) 、汉黄芩素( wogonin) 、汉黄芩苷( wogono － side) 、黄芩新素Ⅰ、Ⅱ ( skullcapfla-vone) 、二氢黄芩苷( dihydroba － icalin) 等。
中国农业大学课程论文（2012-2013学年春季学期）论文题目：钙片中钙含量的测定课程名称：分析化学任课教师：***班级：环境121班学号：***********名：***钙片中钙含量的测定1.钙离子在人体中的作用钙离子是维持机体细胞功能正常的非常重要的离子，它对于维持细胞膜两侧的生物电位、正常的神经传导、正常的肌肉伸缩与舒张以及神经－肌肉传导，还有一些激素的作用机制均有重要作用对于心血管系统，钙离子通过细胞膜上的钙离子通道，进入胞内，通过一系列生化反应，主要是有加强心肌收缩力、加快心率、加快传导的作用。
因此，细胞外钙离子浓度高则会升高血压，使心收缩力加强，每博输出量增大，因而血压也会相应增高。
重要的抗高血压药物有一种便是钙离子拮抗剂，它使得钙离子通过细胞膜上的钙通道的数量减少，使得心肌收缩力减弱，心率降低，血压下降。
其他心血管系统疾病还有充血性心力衰竭、心律失常等的病因均与钙离子关系密切。
钙离子对于骨骼的生长发育有着重要的作用，在青年时，这主要受激素（降钙素、甲状旁腺素等）的调节。
老年人骨骼钙易流失，因此骨骼变脆，变得容易骨折。
2．科学补钙：[1]．我国钙日标准推荐量：6个月以下的婴儿为400mg；6个月～3岁为600mg；3～11岁为800mg；11～13岁为1000mg；13～16岁为1200mg；[2].据全国营养调查，我国31个省、市、自治区平均每人每天摄入钙为406mg；儿童、幼儿钙摄入量为平均每天322mg，低于全国人平均钙摄入量，仅为国家推荐量的40%。
（1）新生儿的体重和身高增长速度较快，需要补钙。
2-3岁的宝宝户外活动时间少，饮食还不够丰富，对钙的吸收就会缺乏，此阶段因缺钙而发生佝偻病或佝偻病症状的可能性特别高，因此也需要服用补钙产品。
（2）女性缺钙从30岁开始，到了40岁以后，每年丧失骨质约1%；在更年期后，骨质丧失进一步加重，导致骨质疏松。
目前我国孕妇和哺乳妇女平均每日钙摄入量仅为国家钙日推荐量的50%（我国钙日推荐量孕妇早期为1000mg、晚期及乳母为1500mg）。
细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定
按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。
Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。
Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。
后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。
并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。
因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+的浓度。
但优于Fura-2/AM的是，Fluo-3与Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。
此外，Fluo-3与Ca2+亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。
Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。
Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i的基本原理如图7.1所示。
图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理
a，代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载；
c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。
Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe.
[Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。
具体过程如下：
1 Ca2+荧光探针负载
1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃恒温轻轻振荡，孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定
2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i
1.Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。
测定条件为：
激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。
2.取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在
上述测定条件下，以激发光波长300 ~ 450 nm，发射光波长500 nm进行扫描，检
查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在340 nm左右处为
最佳负载状态。
3.将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)，按以上参数执行双
波长测定。
4.测定最大荧光比值(R max)和最小荧光比值(R min)：加破膜剂Triton X-100(终浓度为
0.1%)，使Fura-2和Ca2+结合达饱和时，测得的F340/F380为R max；加入高浓度的Ca2+
螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游离，测得的
F340/F380为R min。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i
1.对于1组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以488 nm
的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+的荧光
强度及分布变化，拍照。
2.对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细
胞内Ca2+荧光强度的变化。
激发波长为488 nm，发射波长为515 nm，采样频率为
488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。
细胞内Ca2+荧光强度变化图像由随机软件进行分
析处理，得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间~ 效应曲线，再转换为时
间~ [Ca2+]i曲线。
激光扫描参数在整个实验过程中不变。
为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复3次，结果重复性良好。
2.3 [Ca2+]i的计算
根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。
Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：
[Ca2+]i = K d[(R-R min)/(R max-R)](F min/F max)
其中，K d为Fura-2与Ca2+反应的解离常数，为224 nM；R为各测定点F340/F380荧光强度比值；R max、R min分别为上述测定的最大和最小荧光比值；F min、F max分别代表Ca2+为零及饱和时，在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。
实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。
Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为：
[Ca2+]i = K d[(F-F min)/(F max-F)]
其中，K d为Fluo-3的解离常数，为400 nM；F为对样品检测得到的荧光强度值，F max、F min 分别为加0.1% Triton X-100及5 mM EGTA 时测得的荧光强度值。
