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花粉管通道转化技术及其分子验证花粉管通道法，亦称授粉后外源基因导入植物遗传转化技术，是利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引导组织），经珠心通道将外源DNA 携带进入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞（精子、卵子），由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态，并且正在进行活跃的DNA 复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA 片段整合进受体基因组中，以达到遗传转化的目的。
该法的提出是基于Hess（1980）的试验，他报道了花粉粒可以吸收外源DNA的结果（李长缨等，2000）。
我国学者在远缘杂交的基础上，通过授粉时混入异源花粉匀浆的方法，在后代中发现了对应性状的变异，从而推测可能有异源DNA 参与了受精过程。
Zhou 等（1983）成功地将外源海岛棉DNA 导入陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，创立了花粉管通道法转化技术。
目前，已有的研究结果表明，花粉管通道法介导的遗传转化及其后代能产生变异，已相继在40 多种作物上取得了显著成效（孔青等，2005；Song et al，2007）；在国外SCI/EI 期刊也相继出现报道（Luo et al，1989；Li et al，2002；Shou et al，2002 ；Chen et al，2008），并已获得大量优良小麦等作物新品种（周春江等，2007；王永芳等，2009），为拓宽作物抗性基因资源和品质改良提供了新的途径。
一、花粉管通道法的产生及分类花粉管通道法最早要追溯到Pandey（1975）以烟草为材料，将供体品种的花粉经射线杀死后与受体品种的新鲜花粉混合授粉，结果获得了供体花色性状的变异。
我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in Enzymology”报道了将外源海岛棉DNA 导入陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，创立了花粉管通道法。
此后人们对花粉管通道法进行了大量的研究，研究内容包括外源DNA 的转化机理、转化技术、转化后代的性状鉴定等方面，并把此项技术成功地运用到育种实践中来。
遗传转化技术遗传转化技术（Genetic transformation）是一种将外源DNA导入目标细胞以改变其遗传性状的生物技术。
通过遗传转化技术，科学家可以将特定基因导入目标生物体，从而使其表达具有特定功能的蛋白质或产生特定的代谢产物。
这项技术在农业、医学和生物学研究领域都有重要的应用，可以帮助改良农作物、生产药物和研究基因功能等。
本文将从遗传转化技术的原理、方法、应用和未来发展等几个方面进行详细介绍。
一、遗传转化技术的原理遗传转化技术的原理是通过将外源DNA导入目标细胞，使其在目标细胞中稳定表达而产生特定的遗传性状。
这一过程包括DNA的导入、整合和表达等步骤，下面将分别介绍这些步骤。
1. DNA的导入DNA的导入是遗传转化的第一步，有多种方法可实现DNA的导入，包括化学转化、生物弹道法、冷冻转化法等。
其中，最常用的方法是利用冷冻转化法和冷冻方式使DNA导入目标细胞。
此外，也可以利用质粒、病毒和细菌等载体将DNA导入目标细胞。
2. DNA的整合DNA的整合是指外源DNA在目标细胞中的稳定整合，以确保其可以稳定地在细胞中传递和复制。
整合是遗传转化的关键步骤，其研究是提高转化效率和稳定性的重要途径。
3. DNA的表达DNA的表达是指外源DNA在目标细胞中被转录和翻译，最终产生特定的蛋白质或代谢产物。
DNA的表达与其整合程度、基因调控、转录水平等因素有关，对DNA的表达进行调控是提高遗传转化效率和稳定性的重要手段。
二、遗传转化技术的方法在遗传转化技术中，有多种方法可以将外源DNA导入目标细胞，并实现其稳定表达。
这些方法包括冷冻转化法、生物弹道法、基因枪法、质粒介导和病毒介导等，下面将对这些方法进行详细介绍。
1.冷冻转化法冷冻转化法是通过使目标细胞在低温条件下，先后进行冷冻和解冻，并向其注入DNA，利用渗透剂和真核细胞基因组重复生成的能力，使外源DNA稳定地整合到目标细胞的方法。
该方法简单、操作方便，适用于多种生物体。
白豌豆的遗传转化与基因功能验证白豌豆（Pisum sativum），作为一种重要的农作物和园艺植物，广泛种植于全球各地。
在农业生产中，白豌豆的耐逆性、抗病性等基因功能非常重要。
为了更好地改良白豌豆的性状并提高产量，科学家们不断进行白豌豆的遗传转化与基因功能验证研究。
遗传转化是指在基因工程中将外源基因导入到目标植物中，从而改变其遗传特性的过程。
对于白豌豆来说，遗传转化技术有助于引入具有特定功能的基因，以提高其抗病性、耐逆性等重要性状。
首先，科学家们必须确定适合用于白豌豆的遗传转化方法。
目前常用的方法包括农杆菌介导的基因转化和生物物理手段导入基因等。
在农杆菌介导的基因转化中，科学家们将目标基因组插入细菌Agrobacterium tumefaciens，然后将其转移到白豌豆的组织中。
而生物物理手段则包括基因枪法和电穿孔法等，通过物理力量将外源DNA直接导入到白豌豆的细胞中。
一旦成功进行了遗传转化，接下来的关键是验证导入基因的功能是否有效。
基因功能验证是判断转基因植物是否具有期望性状的过程。
对于白豌豆来说，基因功能验证可包括对抗病性、耐逆性等性状的研究。
抗病性是农作物育种中非常重要的性状之一。
通过基因转化技术，科学家们可以引入具有抗病性基因的DNA到白豌豆中。
在基因功能验证中，科学家们需要利用不同的病原体进行感染实验，观察转基因白豌豆的抗病能力。
这些病原体可能包括细菌、真菌等，可以是常见的白豌豆病原体，也可以是其他农作物病原体。
通过观察转基因白豌豆的抗病程度和病症表现，可以评估引入基因是否有效。
耐逆性是另一个重要的基因功能。
白豌豆在生长过程中会面临各种环境胁迫，如干旱、高温等。
通过基因转化技术，科学家们可以导入一些耐逆性基因，帮助白豌豆在恶劣环境中生长和发育。
基因功能验证中，科学家们可以对转基因白豌豆和野生型白豌豆进行比较实验，观察它们在干旱和高温等胁迫条件下的表现。
通过测量生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性等参数，可以评估转基因白豌豆的耐逆性。
转基因抗虫棉的制备过程
嘿，朋友们！今天咱来唠唠转基因抗虫棉的制备过程。
你想想啊，棉花在地里长着，那虫子多喜欢去祸祸它们呀！这时候转基因抗虫棉就横空出世啦！
先来说说科学家们是咋找到那些有用的基因的吧。
这就好比在一个超级大的基因宝库里面淘宝，得精挑细选，找到那个能让棉花不怕虫子的宝贝基因。
这可不是随便找找就行的，得花费好多心思和精力呢！
找到了基因，接下来就得想办法把它弄到棉花里面去呀。
这就好像给棉花做个小手术，把这个抗虫的基因给它安进去。
这可不是简单地放进去就行，得用一些特别的技术和工具，小心翼翼地操作。
然后呢，经过一番折腾，棉花就有了抗虫的能力啦！你说神奇不神奇？就好像棉花突然有了一身铠甲，那些虫子再也不能轻易欺负它了。
这转基因抗虫棉种下去以后啊，农民伯伯可就省了不少心呢！不用老是担心虫子把棉花都吃光了。
而且这棉花长得还特别好，产量也高，这不是皆大欢喜嘛！
咱再想想，如果没有转基因抗虫棉，那得有多少棉花被虫子毁掉呀？那得损失多少啊！现在有了它，就像是给棉花界带来了一场革命。
你们说，这转基因技术是不是很厉害？它能让我们的生活变得更美好呀！虽然可能有些人对它还有些疑虑，但是咱得相信科学呀！科学总是在不断进步的，它会给我们带来更多的惊喜和好处。
反正我是觉得转基因抗虫棉挺好的，你们呢？。
（VIP&校本题库）2021-2022学年陕西省渭南市蒲城中学高二（下）期中生物试卷一、选择题(本大题共30小题，每小题2分，共60分。
每小题给出的四个选项中，只有一个选项最符合题目要求)1．（2分）科学家发现将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106μg/mL，只相当于天然产品的十分之一，通过基因定点突变将第17位的半胱氨酸改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的β一干扰素的抗病性活性提高到108μg/mL，并且比天然β一干扰素的贮存稳定性高很多．此项技术属于（ ）A．细胞工程B．胚胎工程C．蛋白质工程D．基因工程2．（2分）如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次为（ ）A．解旋酶、限制酶、DNA连接酶B．限制酶、解旋酶、DNA连接酶C．限制酶、DNA连接酶、解旋酶D．DNA连接酶、限制酶、解旋酶3．（2分）在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是（ ）①一个表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子②启动子是一段有特殊结构的DNA片段，有了它才能驱动基因转录出mRNA③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止④所有基因表达载体的构建是完全相同的A．②③B．①②C．①④D．③④4．（2分）转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是（ ）A．检测抗虫基因是否导入--农杆菌转化法B．检测抗虫基因是否转录--分子杂交技术C．检测抗虫基因是否翻译--抗原-抗体杂交D．检测抗虫蛋白生物功能--抗虫接种实验5．（2分）下列关于基因工程工具酶的说法，正确的是（ ）A．E．coliDNA连接酶既能够连接平末端，也可以连接黏性末端B．每种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点进行切割，验证了酶的专一性C．E．coliDNA连接酶可以连接DNA分子中的氢键D．限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程常用的工具酶6．（2分）基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是（ ）A．载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”B．载体能协助目的基因在受体细胞中复制C．载体含有启动子和终止子协助目的基因表达D．载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞7．（2分）据研究，新冠病毒表面的S蛋白是其主要的病毒抗原，在康复病人的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。
抗虫棉基因工程的过程
抗虫棉基因工程的过程
抗虫棉基因工程是指经过基因技术改良的棉花，能够有效抵御害虫的危害，实现棉花的高产和优质，从而提升农业产值。
它的过程大致可以分为以下几个步骤：
1. 确定抗虫基因：通过对天然具有抗虫特性的植物进行深入研究，查找特定的基因，确定对应的抗虫基因。
在棉花中，针对棉铃虫的抗虫基因主要是Bt基因。
2. 克隆和注入基因：通过克隆技术，将确定好的抗虫基因进行扩增，得到高纯度的抗虫基因。
然后，通过注入技术将抗虫基因注入到棉花的基因组中，使其在生长过程中能够表达抗虫特性。
3. 转化体细胞选择：将注入基因的棉花体细胞培养在含有抗生素的培养基中，筛选能够生长的细胞，将其分离出来，得到具有抗虫特性的转化体细胞。
4. 物种再生：将筛选出的转化体细胞进行再生培养，形成完整的棉花植株。
在这个过程中，需要对棉花植株进行基因筛选和鉴定，确保其
拥有预期的基因组和抗虫特性。
5. 田间试验和商业化推广：在田间环境下，通过对抗虫棉花进行田间试验，评估其在实际生长环境中的表现。
根据试验结果，进行商业化推广，将抗虫棉花推广到市场上。
总的来说，抗虫棉基因工程的过程需要经过多个环节的研究、实验和推广，需要专业的技术团队和大量的经费支持。
虽然这项技术能够有效提升棉花产量和品质，但仍面临一些风险和挑战，需要持续投入研究和开发，才能实现其最大价值。
棉花GhERF14基因在拟南芥中的功能验证作者：赵龙飞袁玥明聪来源：《种子科技》2020年第11期摘要：随着分子生物学的不断发展，在模式植物拟南芥中初步探索分析基因功能的方法日渐成熟。
为了探索棉花GhERF14基因的功能，构建过表达载体，通过转基因技术转入拟南芥中，通过筛选纯化获得纯合体转基因植株，观察表型，发现GhERF14基因对拟南芥的生长状况有一定的抑制作用，初步分析基因的功能为后续研究奠定一定的基础。
关键词：拟南芥;GhERF14基因;功能验证1 材料野生型、拟南芥大肠杆菌感受态DH5α、农杆菌菌株GV3101，植物过表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS（含KnptⅡ基因）由本实验室保存。
2 试验方法2.1 拟南芥pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14过表达载体的构建过表达载体在试验前期已经构建好的目的基因与带有35S的过表达载体连接即可，方法可参照目的基因与PMD19-T的连接方法。
2.2 电击法转化pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14重组质粒转移到农杆菌GV3101将验证好的质粒利用电击的方法转入农杆菌GV3101中。
2.3 拟南芥侵染液配制将含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14重组质粒的农杆菌新鲜菌液1‰加入含有50 mg/L的Kan、50 mg/L的Rif的新鲜灭菌LB液体培养基中，置于28 ℃、200 rpm的恒温摇床30～36 h，直至菌液呈橘黄色，菌液OD600值为0.6左右为止。
缓冲液配置500 mL体系：MS Medium 1.185 g、蔗糖25 g、Swillter-77 150μL、乙酰丁香酮（AS）500μL。
4 ℃，5 000 g离心沉淀摇好的菌液，弃上清，用配制好的缓冲液在冰上悬浮，直至OD600值为0.5左右为止[1]。
2.4 拟南芥的侵染利用农杆菌介导法转化拟南芥，取已经盛开的拟南芥植株，用剪刀去除果荚和花败的花，将花蕾浸泡于已经配制好的侵染液中，花蕾充分接触侵染液，时间不超过1 min，对侵染结束的植株进行遮光处理24 h，温度为23 ℃。
转基因抗虫棉的生产方法
随着人口的不断增长和经济的发展，粮食和纺织品需求不断增加。
但是，农业生产面临严重的损失，其中最主要的问题就是虫害。
转基因抗虫棉是许多国家的重要之举，通过转基因技术，从其他生物种类中引进抗虫基因，使得棉花在生长过程中对虫害更加抗拒，从而将棉花产量的损失降至最低。
下面，我们来详细了解一下转基因抗虫棉的生产方法。
第一步：筛选抗虫基因
转基因棉花的主要目的是提高棉花抗虫性，因此在生产之前，首先需要从其他生物中选择具有优良抗虫性的基因。
例如，引入来自取籽小蠹或焦糖盲蝽的基因，可以使棉花对这两种常见的害虫产生抗性。
第二步：将抗虫基因转入棉花
将筛选出的抗虫基因转入棉花的方法有多种，比较常见的是农杆菌介导的转化方法。
在这种方法中，先将被筛选出来的基因克隆到农杆菌T-DNA上，再将该T-DNA转入棉花幼胚的细胞中。
第三步：筛选具有抗虫性的棉花植株
将农杆菌介导的转化后，得到的棉花幼胚，经过一段时间的培养，可以得到具有转基因抗虫基因的棉花植株。
然后，在大棚环境下，对这些植株进行蚜虫、取籽小蠹等常见害虫的人工感染，筛选出哪些转基因植株抵御虫害，产量仍高，这些棉花就是成功的转基因抗虫棉。
第四步：繁殖和推广
筛选出的转基因抗虫棉经过多年的实验表明，该品种在抗虫方面表现更优秀，具有很高的抗虫性和较高的产量。
因此，生产商会将这些棉花繁殖，推广到生产中，以提高棉花生产效益。
总的来说，用遗传工程技术改良棉花，使其具有抗虫性，是一种有效的防治虫害的方法，通过不断地改进，提高棉花的产量和质量，同时也能够保障棉农的收益。
减少,而Ò型黏液细胞数量则相对逐渐增多。
国外有学者[10-12]研究表明杯状细胞的数目以及其分泌的糖蛋白的物理化学性质可能受基因控制。
因此作者推测,La 3+可能会抑制Ñ、Ó、Ô型,而促进Ò型黏液细胞基因表达,而在鳃和消化道的不同部位,不同类型黏液细胞的数目不同,因此在La 3+短时间的暴露下,由于Ñ、Ó、Ô型黏液细胞的减少,而使鳃和口腔、中肠、后肠的黏液细胞密度比相应对照组减少,但随着暴露时间的延长,由于Ò型黏液细胞大量增加,最终又使黏液细胞密度较相应对照组显著增加,其作用机制有待进一步研究。
而无论短期或长期暴露,前肠黏液细胞数量均有所增加,原因可能与前肠肠腔内的酸碱度有关。
总之,镧暴露到一定时间,能使黏液细胞数量大量增加。
黏液细胞数量的增加,分泌的黏液增多,一方面有利于食物在消化道内的移动,另一方面,可有效地防止病原菌侵入,增强鲤鱼免疫能力,这也许就是稀土元素镧作为饲料添加剂,能提高鱼类抗病能力的原因之一。
至于稀土元素是通过何种机制来影响鱼类黏液细胞的数量和种类有待进一步深入研究。
致谢:实验得到楚德昌教授、邓振旭教授,朱道玉副教授,张红梅硕士的大力帮助,谨致谢意!参考文献:[1]杨利文,安利国.鱼类黏液细胞研究进展[J].水产学报,1999,23(4):403-407.[2]安利国,尹苗,杨桂文,等.鲤幼体黏液细胞对不同PAH 刺激反应[J].齐鲁渔业,2000,17(1):27-28.[3]江振莹.稀土元素对鲤鱼增产效果试验[J].华北农学报,2005,(1):122-124.[4]江振莹,贾志海,郭云锁,等.稀土元素对鲤鱼肠道发育及消化酶活性的影响[J].动物营养学报,2007,19(1):86-90.[5]邓振旭,楚德昌.消化道组织块黏液细胞的组织化学染色[J].生物技术,2007,17(6):41-43.[6]任素莲,傅郁.海湾扇贝外套膜的组织结构与黏液细胞的类型[J].中国海洋大学学报:自然科学版,2006,36(5):739-744.[7]涂序珉,吕慧敏,张翠兰,等.稀土对受照射小鼠免疫功能的影响[J].中华放射医学与防护杂志,2005,25(3):230-231.[8]M.Deveci,M.Eski,M.Sengezer,et al.Effects of ceri um nitrate bathi ng and prompt burn wound e xcision on IL -6and TNF-A levels in burned rats [J].Bu rns ,2000,26(1):41-45.[9]刘佳梅,孟晓婷,陈东,等.混合稀土/常乐0对大鼠脾细胞IL-2和C -IFN 的影响[J].中国稀土学报,2003,21(3):328-330.[10]Sands BE,Ogata H,Lanch-Devaney K,et al.Molecular cloning of the rat intes tinal trefoil factor gene:Characterization of an intes ti nal goblet cell-ass ociated promoter[J].J Biol Chem ,1995,270(16):9353.[11]Tmi taM ,Itoh H,Ishikawa N,et al.Molecular cloning of mouse intes tinal trefoil fac tor and its expression during goblet cell changes [J].Biochem J ,1995,311(1):293.[12]Komiya T,Tanigawa Y,Hirohashi S.Cloning of the gene gob-4,whic h is e xpressed in intes tinal goblet cell i n mice[J].Biochem Biophys Acta Gene Struct Express ion ,1999,1444(3):434.技术与方法TEC HNIQUE AND ME THODS筛选转抗寒基因棉花的简便方法周小云1,马盾1,危小薇1,艾秀莲2,黄乐平1(1.新疆农业科学院核技术生物技术研究所,新疆农作物细胞工程重点实验室,新疆乌鲁木齐830091;2.新疆农业科学院微生物研究所,新疆乌鲁木齐830091)摘要:该研究直接利用自然低温条件,在试验田对转抗寒基因的棉花植株的抗寒表现进行分级鉴定和筛选,再将抗寒能力强的植株进行标记基因表达和分子生物学检测,获得转抗寒基因的棉花植株。
转基因抗虫棉的遗传转化与功能验证 一、农杆菌介导的棉花胚胎再生遗传转化体系 （一）实验方法 以W0为受体，将pC2-dsGFP、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH3、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP载体的农杆菌菌株，运用农杆菌介导法分别将目的基因转入棉花下胚轴，通过组织培养技术获得转基因再生株系。
嫁接试验采用根系发达抗病性强的海岛棉（海7124）的实生苗做砧木，接穗是转化基因再生植株。 （二）实验步骤 农杆菌介导的棉花遗传转化分3步，转化、胚胎发生和植株再生。 1）种子脱绒：轧花后的棉花种子，烘干（40℃左右），用适当硫酸（H2SO4）脱去短绒，自来水洗掉种子表面浓硫酸，充分晾干； 2）种子的消毒处理：选取饱满棉花种子于无菌三角瓶中，无菌水冲洗一次，70%乙醇表面消毒种子30 Sec，弃去乙醇，加入30%过氧化氢（H2O2）于摇床振荡2-3 h，弃掉H2O2，无菌水冲洗种子3-5 次，保留少量无菌水浸过种子，存放28℃，18-24 h，待到种子破壳露白； 3）外植体制备：在无菌条件下，滤掉消毒过种子的无菌水，剥去种子种壳，接种于苗培养基（1/2MS）上， 28 ℃黑暗培养（N）3 d，然后在28℃、3000-5000 Lx光照下培养 (D/N＝16 h/8 h) 3 d。 4）农杆菌活化与浸染液制备：将-70℃保存的农杆菌载体菌株，取出冻融。在固体LB平板培养基上（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）划线，28℃静止培养1-2天。平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体（Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养基（10ml）中，28℃振荡过夜，再按1%接种量转接入50mL新鲜培养基中（含Kan 50μg/ml＋Rif/Str 50μg/ml）培养8小时左右，测定OD600为0.5左右。4℃，5000rpm离心5min ，收集菌体。然后用5mLMSB0（含100 uM/ml AS）液体培养基重新悬浮沉淀，再转入15-45mL的 MSB0（含100uM AS）液体培养基，28℃摇床上培养至OD600为0.5左右，稀释培养液OD600 值0.3-0.7 时备用。 5）浸染与共培养：在超净台上使用手术刀切割茎段7cm左右，将下胚轴茎段浸泡于农杆菌侵染液中5-8 min，用灭菌滤纸吸干胚轴段菌液，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基上，用封口膜封口，22℃～25℃共培养2d。 6）下胚轴切段两端切口长出的愈伤组织直径大约0.5-1.0 cm时切下来单独继代，愈伤组织块的直径大约2 cm时转移到胚性愈伤组织诱导培养基上。 7）转化组织从1个或几个细胞开始分裂，3-4个月即有蚕豆大小（直径2 cm左右）。 8）愈伤在MSB上长到直径2cm左右，接种到MSB2诱导胚性愈伤，在MSB2
上继代1-3次即会有胚性愈伤的出现。
9）待愈伤组织长到直径约2-3cm 时，将其从胚轴段切除，愈伤组织块转入相同的培养基增殖，可以有效的去除农杆菌和防止愈伤组织褐化现象。 10） 当愈伤组织块直径达到7-8 mm 放入胚性愈伤诱导培养基中，在培养间常规条件下培养，每隔一个月左右转一次相同的培养基，2-6 次，到出现黄绿色或灰绿色，米粒状的胚性愈伤为止。 11） 只要疑似分化就挑出来少许，分散继代到分化培养基上，在分化培养基上能生存的一般是胚性愈伤组织，而非胚性愈伤在分化培养基大多不能存活。 12） 由胚性愈伤再生植株经历体细胞胚的形成、成熟、萌发和小植株的生长。经过10天左右的抗性胚筛选，将成活的胚性愈伤挑到瓶口包棉塞、使用透气瓶塞培养瓶里培养，促进胚状体的形成和萌发。 13） 将萌发的小植株平铺接种到铺滤纸的培养基上，诱导成苗。小植株再转入大的三角瓶中（培养基同愈伤组织增值配方），无菌条件下取小植株2－3 片叶，小量法提取DNA，进行标记基因和目的基因的PCR 扩增，将阳性小植株嫁接温室。 14） 在装有营养土的土盆中种上根系发达、抗逆性强的海岛棉或育成品种（抗病、植株旺盛），待棉苗3-5 片真叶时待用（称砧木苗）。用劈接法和插皮接法将转基因再生棉株嫁接到砧木苗上（吴慎杰等，2007）。 15） 嫁接后的管理：嫁接后3-4d通气，即旋开瓶盖罩住瓶口2/3，以防接穗发霉，7 d去掉瓶盖，10-12 d揭瓶，15 d左右解绳成活。为了让其快速生长，成活后用霍格兰营养液浇一次。
（三）农杆菌介导棉花下胚轴转化
利用优化了的陆地棉体细胞再生转化体系，以转化模式品种W0为受体，利用带有目的基因的农杆菌载体菌株EHA105与棉花下胚轴进行共培养后，经过一系列的组织培养再生过程，获得大量的转基因株系。 （四）实验结果 目前，转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1、 pC2-dsGFP载体转基因抗虫棉获得再生植株的情况如下，后续实验还在进行中。 pC2-dsPTTH3 ：已获得20个克隆，10个克隆已嫁接成苗，有2个克隆已经拿到T1代种子。 pC2-dsPTTH5 ：已获得30个克隆，有25个克隆已出大量小苗，20个左右克隆已嫁接，其中几个克隆已结铃。 pC2-dsJHAMT ：已获得61个克隆，35个克隆已出大量小苗，嫁接20个克隆，还有小苗待嫁接。 pC2-dsJHBP1：已获得15个克隆，12个克隆嫁接，有2个克隆已经拿到T1代种子，已南繁。 pC2-dsGFP ：已获得5个克隆，其中3个克隆均嫁接成活，收到T0代种子。
1. pC2-dsPTTH3
2. pC2-dsJHAMT 3. pC2-dsPTTH5 4. pC2-dsJHBP1 5. pC2-dsGFP 二．pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1转基因株系的分子检测结果 用CTAB法提取转基因株系叶片的基因组DNA，以目的基因的特异性引物进行PCR扩增。结果如下： （注：各载体获得的转基因后代株系，具体实验还在进行中，后续将获得更多克隆数，并进一步进行分子检测。所以，现获得检测结果没有具体统计。） （一）pC2-dsPTTH3
T0代验证： 1为marker；2为阳性对照；5为加水阴性对照； 3、4、6、7、8、9、10、11分别为转基因不同株系 （二）pC2-dsPTTH5 T0代验证：1为marker；2为阳性对照；3为水阴性对照； 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16分别为转基因不同株系
（三）pC2-dsJHAMT
T0代验证：1为marker；2为阳性对照；3为加水阴性对照； 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18分别为转基因不同株系
（四）pC2-dsJHBP1
T0代验证：1为marker；2为阳性对照；13为加水阴性对照； 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、分别为转基因不同株系 T1代验证:1为marker；2为阳性对照；12为加水阴性对照；3、 4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18分别为转基因不同株系
（五）pC2-dsGFP
T0代验证：1为marker；2为阳性对照；8为加水阴性对照； 3、4、5、6、7分别为转基因不同株系
三、转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1载体转基因棉花抗虫遗传性分析 （一）转不同世代pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉材料的抗性分离情况： 本实验将依据抗虫转化植株筛选和生物鉴定的结果，并根据田间生长情况和种子成熟状况，选择部分转化材料进行南繁，对其T2代(T1代自交获得T2代)、T3代(对T2代中的部分抗虫单株自交获得T3代)材料的抗虫性分离情况进行遗传分析。 （二）转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉不同发育时期抗虫性分析 本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。将分别于棉花苗期、蕾期和铃期取各种试验材料倒3位或倒4位展开叶，接棉铃虫初孵幼虫进行室内抗虫性生物检测。每材料接15管，每管接棉铃虫幼虫5头，重复3次。调查72h幼虫死亡率及叶片受害面积。 （三）转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉相同时期不同器官的抗虫性分析 本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。于棉花生长花铃期分别取其棉叶、棉蕾、花瓣、(未成熟)棉桃等组织器官材料进行棉铃虫饲喂试验。不同组织器官(材料)均接虫30管，每管接入棉铃虫幼虫1头，重复取样3次。调查72小时幼虫死亡情况。 （四）不同龄期棉铃虫幼虫对转基因抗虫棉的敏感性分析 本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。于棉花生长蕾期分别取其倒3叶或倒4叶，并分别接入1龄、3龄、5龄棉铃虫幼虫进行抗虫棉抗性鉴定研究。每组试验安排30管，每管接入幼虫1头，设3次重复。调查72小时幼虫死亡情况及叶片受害面积 （五）转基因抗虫棉对不同世代棉铃虫的敏感性分析 本实验将以转基因抗虫棉为实验材料，以非转基因抗虫棉为阴性对照，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。在第2代、第3代、第4代棉铃虫发生期间，分别以棉花叶片和棉蕾为试验材料进行抗虫性分析研究。每处理为15个样管，每样管接入棉铃虫3龄幼虫l头，设3次重复。调查72小时幼虫死亡情况。 （六）环境条件对转pC2-dsPTTH3、pC2-dsJHAMT、pC2-dsPTTH5、pC2-dsJHBP1基因抗虫棉抗性的影响 本实验将以我国三大棉区以及沿海植棉区的某些特定或易变气候、环境条件，设计温度变化(突然升高、突然降低)、干早和水浸、盐碱等不同试验处理，以了解转基因抗虫棉对环境条件的敏感性。以转基因抗虫棉为实验材料，转 Bt杀虫晶体蛋白基因抗虫棉为阳性对照进行试验。 （1）温度处理试验 在温室内用花盆种植，温度的突然上升和突然下降处理在人工气候箱内进行。试验以正常温室条件下生长的棉花幼苗为环境对照处理，设20℃、30℃、
