微检试验

消毒灭菌技术湿热灭菌法名称方法用途高压蒸汽灭菌法压力103.4KPa,温度121.3℃，15-30min。

即可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物培养基、生理盐水、手术敷料、玻璃制品等耐高温、耐湿的物品煮沸消毒法消毒物品置于水中，加热至100℃后持续5-6min。

杀死一般的细菌繁殖体，但对芽胞无影响适用于直饮水、食具、注射器和手术器械等的消毒流通蒸气消毒法物品放置于蒸笼内，利用100℃的水蒸气进行灭菌，保持15-30min可杀死细菌繁殖体，但不能保证杀死芽胞。

适用于不耐高温的物品灭菌间歇灭菌法灭菌物品置于100℃加热30min,以杀死细菌繁殖体，取出物品放于37℃恒温箱过夜，再次重复100℃加热30min。

此过程重复3次可达到灭菌的目的。

适用于如含糖、鸡蛋或血清等不耐高温的物品灭菌巴氏消毒法①61.1-62.8℃加热30min,;②71,1℃加热15-30s。

牛奶干热灭菌法名称方法用途焚烧适用于无经济价值的物品，如尸体灼烧物品直接放置于火焰中灼烧微生物的接种环、接种针、试管口等干烤法物品置于密封的干烤箱内，灭菌时加热至160-170℃，维持2-3小时。

可杀死一切微生物，包括细菌的芽胞适用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品，如玻璃制品、粉剂药品、凡士林等。

糖类的代谢实验实验原理方法结果应用糖（醇、苷）类发酵实验各种细菌对糖的分解能力及分解糖产生的终产物不同含有指示剂的糖（醇、苷）类发酵培养基中35℃18-24h①分解糖（醇、苷）类；培养基中指示剂呈酸性。

②产气：使液体培养基中倒管内或半固体培养基内有裂缝。

③不分解糖（醇、苷）类；除细菌生长外，培养基中无明显变化。

肠杆菌科细菌的鉴定葡萄糖氧化/发酵实验（O/F) 根据细菌分解葡萄糖时对氧的需求不同1)氧化型：细菌分解葡萄糖时需氧2)发酵型：细菌在有无氧的条2支葡萄糖培养基，水浴10min驱氧，一支中滴加无菌液体石蜡，隔绝空气。

另一支暴露在空气①产碱型：两支培养基均无变化，②发酵型：两支试管均产酸（发肠杆菌科细菌和非发酵菌的鉴别件下均可分解葡萄糖3)产碱型：不分解葡萄糖中。

均培养35℃18-24h黄）③氧化型：加液体石蜡的培养基不产酸，不加液体石蜡的培养基产酸。

甲基红实验（MR）细菌发酵葡萄糖产生丙酮酸，使PH降至4.4以下，甲基红呈现红色。

产酸量少或产酸后进一步分解为醇、醛、酮等，PH在5.4以上，甲基红呈现黄色葡萄糖蛋白胨水中，35℃2-4天，滴加甲基红试剂红色为阳性黄色为阴性肠杆菌科的鉴别伏普实验（VP) 细菌发酵葡萄糖产丙酮酸后，将其脱羧氧化成二乙酸，与培养基内蛋白胨中精氨酸的胍基反应，生成红色化合物细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，35℃18-24h后加入甲液0.6mL，乙液0.2mL。

红色或橘红色均为阳性肠杆菌科的鉴别β-半乳糖苷酶实验（ONPG）有的细菌有β-半乳糖苷酶，能分解β-半乳糖苷而释放黄色的邻硝基酚。

细菌分解葡萄糖靠：半乳糖苷渗透酶，位于胞膜上运送乳糖进入细菌接种至1%乳糖肉汤琼脂培养基上培养35℃18-24h后将菌置于0.25mL生理盐水中①出现黄色则为阳性（20min-30min内显黄色）②3h后不出用于迟缓发酵乳糖菌株的鉴定。

迅速及迟缓分解乳糖的细胞；β-半乳糖苷酶，位于胞内，使乳糖水解成半乳糖或葡萄糖。

乳糖发酵迟缓菌只有β-半乳糖苷酶（胞内酶），乳糖进入细菌慢，出现迟缓发酵现象。

ONPG 结构与乳糖相似，但分子小易进入细菌被β-半乳糖苷酶水解出现黄色的邻硝基酚。

从而可测得β-半乳糖苷酶的存在，得该菌为乳糖发酵迟缓菌。

制成悬浮液，加入甲苯，37℃水浴5min后加入0.25mL ONPG,水浴后观察结果现黄色为阴性细菌ONPG为阳性不发酵乳糖的细菌为阴性七叶苷水解实验某些细菌能分解七叶苷产生葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中Fe2+ 结合后形成黑色化合物细菌接种到七夜苷培养基中，培养35℃18-24h后观察结果培养基变黑色为阳性培养基不变色为阴性D群链球菌与其他链球菌的鉴别。

前者为阳性，后者为阴性。

蛋白质和氨基酸代谢实验实验原理方法结果应用靛基质（吲哚)实验某些细菌含有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸而产生靛基细菌接种到蛋白胨水培养基中，35℃两液面接触处呈红色为阳性，黄色为主要用于肠杆科细菌的质（吲哚），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰靛基质。

24-48h,取出后加入靛基质试剂，轻摇后观察两液面接触处的颜色。

阴性鉴定。

大肠杆菌呈阳性，沙门菌属为阴性硫化氢生成实验有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸）生成H2S,H2S与培养基中的Fe2+(或Pa2+)反应生成黑色的硫化铁（或硫化铅）细菌接种到含硫化亚铁或醋酸铅的培养基中，35℃18-24h后观察结果有黑色沉淀的为阳性无黑色沉淀的为阴性用于肠杆菌科菌属间的鉴定尿素酶实验有些细菌能产生尿素酶，分解尿素为氨和CO2，氨溶解在水中形成碳酸铵，培养基呈碱性，是酚红指示剂显红色细菌接种到尿素培养基中，35℃18-24h后观察结果培养基呈红色反应为阳性不变色或呈黄色为阴性用于肠杆菌科细菌、幽门螺杆菌等的鉴定苯丙氨酸脱氨酶实验某些细菌能产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与10%的三氯化铁作用形成绿色化合物细菌接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，35℃培养18-24h后，在斜面滴加4-5滴10%的三氯化铁水溶液，使其在琼脂斜面上缓缓流下，充呈绿色的为阳性反应无色的为阴性用于肠杆菌科细菌的属间鉴定分与细菌接触氨基酸脱羧酶实验某些细菌能产生氨基酸脱羧酶，可分解氨基酸使其脱去羧基生成胺和CO2,胺是培养基呈碱性检测的细菌接种到2支氨基酸脱羧酶的培养基中（一支不含氨基酸作为对照，一支含有赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸），再在培养基上覆盖一层灭菌的液体石蜡，35℃培养18-24h对照管应呈现黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，呈黄色为阴性。

若对照管呈现紫色则实验无意义，不能做出判断用于肠杆菌科的细菌的鉴别碳源利用实验实验原理方法结果应用枸橼酸盐利用实验某些细菌能够利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能够利用其中的铵盐作为唯一的氮源。

细菌生长过程中能分解枸橼酸盐产生碳酸盐，分解铵盐产生氨，二者是培养基呈碱性，使溴麋香草酚蓝指示剂显蓝色。

细菌接种于枸橼酸盐培养基中，35℃培养24-48h观察结果。

如为阴性，应继续培养至第4天观察培养基应呈深蓝色为阳性阴性者培养基中无菌生长，仍为绿色用于肠杆菌科细菌的鉴别丙二酸盐利用实验某些细菌可利用丙二酸盐作为唯一的碳源，将丙二酸盐分解生成醋酸钠，使培养基变为碱性，溴麋香草酚蓝指示剂呈现蓝色。

细菌接种于丙二酸钠培养基上，35℃培养24-48h观察结果培养基为深蓝色为阳性培养基颜色不变者为阴性用于肠杆菌科细菌的鉴别酶类实验实验原理方法结果应用氧化酶（细胞色素氧化酶）实验某些细胞具有氧化酶(细胞色素氧化酶）能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺氧化生成红色的醌类化合物。

取洁净滤纸条，蘸取细菌菌落，滴加氧化酶试剂于菌落上，或将试剂直接滴加在被检菌落上。

此方法避免触碰含铁物质，因遇铁会出现假阳性。

阳性立刻出现红色，继而变为深红色至深紫色用于肠杆菌科细菌（阴性）与假单胞菌（阳性）的鉴别触酶（过氧化氢酶）实验有些细菌具有触酶（过氧化氢酶），能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成氧分子出现气泡接种环取被检菌少许，置于玻片上，滴加3%过氧化氢试剂1-2滴，观察结果。

【本实验不适用于血琼脂平板上的菌一分钟内产生大量气泡为阳性不产生气泡为阴性常用于革兰阳性球菌的初步分类。

葡萄球菌属、微球菌属触落，易出现假阳性】实验时应做阳性和阴性对照；30%的过氧化氢仅用于奈瑟菌属中淋病奈瑟菌与其他奈瑟菌的鉴别酶实验为阳性，链球菌属为阴性硝酸盐还原实验某些细菌能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用生成重氮磺酸，再与α-萘胺结合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸（红色化合物）将被检细菌接种于硝酸盐的培养基中，35℃培养18-24h，加入甲、乙液的等量混合液，观察结果①立即或10min内出现红色者为阳性加入试剂不出现红色，需要检查硝酸盐是否被还原，可在培养基中加入锌粉②无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐还原实验为阳性③红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，待检菌无还原硝酸盐的能力，用于鉴别肠杆菌科细菌、假单胞菌及厌氧菌硝酸盐还原实验为阴性凝固酶实验金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。

凝固酶有两种：一种是结合凝固酶结合在细胞壁上；另一种是分泌到菌体外的游离凝固酶。

玻片法：取未稀释的兔血浆和生理盐水各一滴分别置于载玻片的两侧，挑取待检菌株少许分别与他们混合，立刻观察结果。

此法用于测定结合凝固酶。

细菌在生理盐水中无自凝，菌液呈均匀浑浊状态，凝固酶实验为阳性，菌液聚集成团块或颗粒状，则凝固酶为阴性。

主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定DNA酶实验某些细菌产生DNA酶，能分解培养基中的DNA，使长链DNA水解成寡核苷酸链。

因为长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链则溶于酸，在琼脂平板上加入酸后，寡核苷酸链溶于其中，故菌落周围形成透明环被检菌接种于DNA平板上，35℃培养18-24h后，在平板表面滴加一层1mol/L盐酸，厚度使菌落浸没菌落周围出现透明环者为阳性，无透明环者为阴性可用于葡萄球菌、沙雷菌及变形杆菌的鉴定，三者均为阳性复合生化实验实验原理方法结果应用克氏双糖铁琼脂KIA琼脂中乳糖：葡萄糖=10:1.若细菌只分解葡萄糖而不分解用接种针挑取待检菌，先穿刺接种到1)斜面碱性，底层碱性：不发酵糖主要用于肠杆菌科（KIA)培养基实验成分：牛肉膏、蛋白胨、乳糖（10）、葡萄糖（1）、枸橼酸铵铁、酚红指示剂乳糖，则培养基中细菌只分解少量葡萄糖产生少量的酸，在最初培养的8-12h内，这些酸使培养基底层和斜面中的酚红变黄色。

但继续培养数小时后，在细菌和氧的作用下，培养基斜面部分所含氨基酸发生降解释放氨类中和斜面的酸，使斜面转变成碱性（K）而呈红色。

①培养基底层氨基酸降解作用不足以中和所形成的酸，故仍为酸性（A）而呈黄色。

②KIA培养基斜面呈碱性，深层呈酸性反应，说明细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖③若细菌分解大量的乳糖产生大量的酸，培养基的斜面氨基酸分解的氨类不足以中和大量的酸整个培养基呈现酸性，酚红使整个培养基显黄色④如细菌分解培养基中的含硫氨基酸，则可产生KIA深层，距离管底3-5mm为宜，再从深层向上提起，最后在斜面由下而上呈“z”字划线。

培养8-12h后观察结果类，如铜绿假单胞菌。

2)斜面碱性，底层酸性：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，如福氏志贺菌。

3)斜面酸性、底层酸性且有黑色沉淀：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，产生H2S，如鼠伤寒沙门菌数、普通变形杆菌。