2011《生态毒理学报》论文模板

卫生毒理学毕业论文范文一、论文说明本团队专注于毕业论文写作与辅导服务，擅长案例分析、编程仿真、图表绘制、理论分析等，论文写作300起，具体价格信息联系二、论文参考题目氯乙酸甲酯的卫生毒理学评价思路：氯乙酸甲酯是一种应用广泛的化工原料,多用于医药、农药生产的中间体,本试验对其进行了卫生毒理学评价。

采用《国家农药登记毒理学试验方法(GB15670-1995)》和《食品安全性毒理学评价程序和方法(GB15193-94)》,进行了大鼠经口LD_(50)和小鼠经口LD_(50);新西兰大耳白兔经皮肤刺激试验和眼刺激试验;小。

题目：喜树碱作为农用杀虫剂的初步研究思路：喜树(Camptothecia acuminata)是一种速生木本植物,且是我国特有树种,蓝果树科(Nyssaceae)。

喜树碱(Camptothecin)是喜树叶、根皮和果实中的生物碱。

喜树碱对各种动物肿瘤特别对多种药物有耐性的肿瘤相当有效。

迄今为止,有关喜树碱在植物源农药开发上的研究还很少,本项工作发现喜树碱对鳞翅。

题目：两种稀土纳米抗菌材料安全性的动物试验研究思路：本课题从免疫学和卫生毒理学的角度初步研究了两种稀土纳米抗菌材料对豚鼠免疫功能和遗传物质的影响,并对某些器官进行了病理分析,最后对可能存在的机理进行了初步探讨,以期为稀土纳米抗菌材料的安全研究提供一些参考。

首先,根据卫生毒理学所规定的评定外来化合物对机体毒性作用的方法,并结合稀土纳米抗菌材料在。

题目：野菊花黄色素的理化与功能特性研究思路：本文以野菊花(Flos Chrysanthemi indici)为试材,进行野菊花黄色素的研究,具体研究内容和结果如下： 1.野菊花黄色素有两类：一是类胡萝卜素类色素即乙醚提取物,其主要呈色及活性成分为总胡萝卜素,β-胡萝卜素及金属元素等。

二是黄酮类色素即60%的乙醇提取物,其主要呈色及活性成分为总黄酮,槲皮素,。

题目：典型全氟化合物水生毒理学效应与致毒机理初探思路：由于大规模长时间的工业应用，全氟化合物(Perfluororinated Compounds，PFCs)已经对自然环境和人类健康构成了严重威胁。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第4期2023年8月V ol.18,No.4Aug.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金区域创新发展联合基金重点支持项目(U21A20411);湖南省自然科学基金资助项目(2020JJ2016)㊀㊀第一作者:赵昌会(1980 ),男,博士,研究方向为微生物生态学,E -mail:****************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:****************DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221017002赵昌会,陈华海,胡云霏,等.阿奇霉素与人体肠道菌群体外相互作用的初步研究[J].生态毒理学报,2023,18(4):439-449Zhao C H,Chen H H,Hu Y F,et al.Preliminary study of interaction between azithromycin and human gut microbiota in vitro [J].Asian Journal of Eco -toxicology,2023,18(4):439-449(in Chinese)阿奇霉素与人体肠道菌群体外相互作用的初步研究赵昌会,陈华海,胡云霏,李百元,曹林艳,蒋琼凤,尹业师*湖南科技学院化学与生物工程学院,湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室,湖南南岭地区植物资源研究开发湖南省工程研究中心,永州425199收稿日期:2022-10-17㊀㊀录用日期:2022-12-31摘要:研究阿奇霉素对肠道菌群结构及其代谢产物的影响,为阿奇霉素的临床应用提供人体肠道菌群方面的理论依据㊂通过体外分批发酵㊁宏基因组测序及气相色谱等技术探讨阿奇霉素与人体肠道菌群的相互作用㊂结果表明,阿奇霉素暴露后与对照组相比,益生菌双歧杆菌属(Bifidobacterium )㊁片球菌属(Pediococcus )㊁拟杆菌属(Bacteroides )㊁小杆菌属(Dialister )㊁理研菌属(Petrimonas )和乳酸杆菌属(Lactobacillus )等的相对丰度显著降低,条件致病菌罗尔斯顿氏菌属(Ralstonia )和果胶杆菌属(Pecto -bacterium )的相对丰度显著提高(P <0.05);种水平上,长双歧杆菌(Bifidobacterium longum )㊁乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici )㊁德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii )㊁Limosilactobacillus fermentum 和链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum )等的相对丰度显著降低,小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica )和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii )的相对丰度显著提高(P <0.05)㊂阿奇霉素还改变肠道菌群的新生霉素生物合成和核黄素代谢等途径及抗性基因的丰度,并降低乙酸含量,而肠道菌群对阿奇霉素的降解率较低㊂总之,阿奇霉素在体外发酵过程中影响人体肠道微生物群的细菌群落㊁代谢途径㊁耐药基因和乙酸含量㊂本文将为阿奇霉素与人体肠道菌群相互作用的研究提供参考㊂关键词:阿奇霉素;人体肠道菌群;体外发酵;宏基组测序;短链脂肪酸文章编号:1673-5897(2023)4-439-11㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:APreliminary Study of Interaction between Azithromycin and Human Gut Microbiota in vitroZhao Changhui,Chen Huahai,Hu Yunfei,Li Baiyuan,Cao Linyan,Jiang Qiongfeng,Yin Yeshi *Hunan Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South,Hunan Engineering Research Center for Research and Development of Plant Resources in Nanling Area,College of Chemistry and Bioengineering,Hunan University of Science and Engineering,Yongzhou 425199,ChinaReceived 17October 2022㊀㊀accepted 31December 2022Abstract :To understand the effect of azithromycin on the human gut bacterial community and its metabolites,and provide a theoretical basis for the clinical application of azithromycin in human intestines,the interaction between azithromycin and human gut microbiota was studied using batch in vitro fermentation,metagenome sequencing,and gas chromatography.Results showed that azithromycin significantly reduced the relative abundance ofBifidobacterium ,Pediococcus ,Bacteroides ,Dialister ,Petrimonas ,and Lactobacillus ,and significantly increased the440㊀生态毒理学报第18卷relative abundance of Ralstonia and Pectobacterium(P<0.05).At the species level,azithromycin significantly re-duced the relative abundance of Bifidobacterium longum,Pediococcus acidilactici,Lactobacillus delbrueckii,Li-mosillactobacillus fermentum,and Bifidobacterium catenatum,while significantly increased the relative abundance of Yersinia enterocolitica and Ralstonia picettii(P<0.05).Azithromycin also changed the metabolic pathways and the abundance of resistance genes,such as novobiocin biosynthesis and riboflavin metabolism of gut microbiota, and reduced the content of acetic acid.However,the degradation rate of azithromycin by human gut microbiota is slight.In summary,azithromycin affects the bacterial community,metabolic pathway,drug resistance gene,and ace-tic acid content of human gut microbiota during in vitro fermentation.This paper provides reference for the study of the interaction between azithromycin and human gut microbiota.Keywords:azithromycin;human gut microbiota;in vitro fermentation;metagenome sequencing;short-chain fatty acids㊀㊀抗生素对人类或动物疾病的预防和治疗起着至关重要的作用,但抗生素在全球范围内的大量应用对生态系统产生的负面影响令人担忧㊂大量研究表明,长期服用或接触抗生素会扰乱肠道微生物的群落结构和宿主的新陈代谢等㊂据报道抗生素治疗会显著改变肠道菌群结构[1],且造成的菌群多样性变化难以恢复[2]㊂Olekhnovich等[3]发现经抗生素等药物在根治了幽门螺杆菌诱发的疾病后,肠道内青春双歧杆菌的丰度显著降低,粪肠球菌丰度增加的同时其耐药性也明显增强㊂Elvers等[4]调查发现强力霉素显著降低人体肠道内双歧杆菌属的多样性,克拉霉素降低肠杆菌科细菌㊁双歧杆菌和乳酸杆菌的丰度和多样性,而苯氧甲基青霉素㊁呋喃妥因和阿莫西林对人体肠道菌群结构影响较小㊂此外,McDon-nell等[5]也发现儿童期使用抗生素会诱发哮喘㊁青少年关节炎㊁糖尿病㊁克罗恩病和精神疾病等,而这些疾病的发生都与肠道菌群失调密切相关㊂阿奇霉素是一种具有免疫调节作用的大环内酯类抗生素,它通过与细菌核糖体大亚基结合而抑制蛋白质合成,广泛用于感染性疾病的治疗㊂阿奇霉素对分枝杆菌感染有良好的疗效[6],特别是鸟分枝杆菌,在相同疗效下阿奇霉素导致不良事件的机率要比克拉霉素的低[7]㊂随着阿奇霉素的广泛应用,它已成为环境中的常见污染物[8]㊂从长期来看,大量接触或使用阿奇霉素可能会对人体健康产生较强的毒副作用㊂例如,阿奇霉素在治疗支原体感染的过程中会增加其他病原菌的丰度[9],它还会影响T 细胞对肿瘤细胞的抑制[10]㊁诱发小鼠饮食性肥胖[11]㊁增加儿童肠道菌群的耐药性[12]㊁以及加速耐药基因在病原菌间的传播[13];也有研究表明阿奇霉素能增加动物脂肪量和胰岛素抵抗[14],并导致小鼠血脂异常㊁肠道菌群紊乱及焦虑行为[15]㊂另外,阿奇霉素还会显著提高人体肠道中机会病原菌的相对丰度[16],以及改变口腔细菌的菌群结构[17]㊂鉴于阿奇霉素在临床应用中存在一定的毒副作用,而阿奇霉素对青年人肠道菌群结构的影响研究较少㊂本文拟通过体外分批发酵㊁宏基因组测序及气相色谱技术等,探究阿奇霉素暴露对人体肠道菌群结构的影响,以期为全面认识阿奇霉素暴露对人体肠道菌群产生的毒理作用提供参考㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀志愿者招募本试验共招募12名志愿者(男女各半,年龄20至22岁,签署知情同意书)㊂所有参与者身体健康㊁不吸烟㊁不酗酒㊁饮食习惯基本相同,提供粪便样品前3个月内未服用任何药物或益生菌㊂1.2㊀发酵培养基配制对照组(Con)为Ⅵ培养液[18],实验组为含阿奇霉素(azithromycin,AZM,CAS#83905-01-5,纯度98%,上海源叶生物科技有限公司)的Ⅵ培养液㊂根据阿奇霉素口服剂量500mg[19],约47%经肠道排出体外[20],结肠溶液体积约为0.3L[21],计算出结肠内阿奇霉素的实际浓度约为800mg㊃L-1,以此浓度作为本实验浓度㊂1.3㊀肠道菌群悬液制备收集到新鲜粪样后,立即送回实验室,按照粪样与无菌PBS缓冲液(pH7.0,0.1mol㊃L-1)为1ʒ10(gʒmL)的比例混匀,用4层无菌纱布过滤获得肠道菌群悬液,整个过程严格无菌操作㊂1.4㊀体外模拟发酵㊁收集与测序在超净工作台中,将粪便悬液分别接种于对照组和实验组培养液,每4.75mL培养液接种0.25mL第4期赵昌会等:阿奇霉素与人体肠道菌群体外相互作用的初步研究441㊀粪菌悬液,置于37ħ厌氧工作站(V(N2)ʒV(CO2)ʒV(H2)=80ʒ10ʒ10)混匀,发酵48h㊂分别取1.6mL发酵液,12000r㊃min-1离心4min,上清液和沉淀分别暂存于-80ħ冰箱㊂沉淀样本送至深圳微客盟科技集团有限公司,采用CTAB法提取样品的总DNA 并进行质检㊂合格后将每组样品分别按同一方式㊁每4份样品按照等物质的量混合后[22],采用Covaris 超声波破碎仪将DNA随机打断;经末端修复㊁加A 尾㊁加测序接头㊁纯化㊁PCR扩增等步骤,完成整个文库的制备㊂再用Qubit3.0荧光定量仪进行初步定量,稀释文库,随后采用Agilent5400检测文库的插入片段,符合预期后采用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量,最后用Illumina Novaseq平台进行宏基因组测序,模式为PE150,原始数据保存于NCBI数据库(登录号是PRJNA561660)㊂1.5㊀短链脂肪酸分析按照5ʒ1将上述上清液与偏磷酸巴豆酸溶液混匀,置于-20ħ过夜后,室温溶解,12000r㊃min-1离心30min,获得的上清液用气相色谱仪(日本岛津公司,GC2010PLUS),INTERCAP-FFAP色谱柱和火焰离子化检测器进行短链脂肪酸测定[18]㊂1.6㊀阿奇霉素含量检测采用分光光度法[23]检测阿奇霉素含量,方法如下:1mL发酵液中加入0.2mL乙醇混匀,12000r㊃min-1离心10min;取1mL混合液,加入2mL蒸馏水;再于冰水浴中缓慢加入9.76mol㊃L-1硫酸溶液7mL,混匀;60ħ水浴加热30min,482nm检测吸光值㊂1.7㊀宏基因组测序及数据统计分析将获得的原始数据用KneedData软件进行质控和去宿主,合格后采用Kraken2软件和微科盟自建数据库分析有效序列的物种序列数,用Bracken软件估算其实际丰度,并用UMAnN2软件将样本序列与UniRef90数据库比对,获得注释信息和相对丰度表;再将有效序列与抗性基因数据库CARD比对获得注释信息表㊂基于物种㊁功能及抗性基因的丰度表,分析人体肠道菌群结构及功能等㊂采用IBM SPSS Statistics20.0软件实验数据进行差异显著性和相关性分析,P<0.05有统计学意义,并用Graph-pad prism5.0和HemI1.0软件绘图㊂2㊀结果(Results)2.1㊀数据质量分析将Con组和AZM组的24份DNA样品,按照相同分组方式每4份混合为一组,对获得的6份混合样品进行宏基因组测序㊂每个样品平均获得原始序列2.3ˑ107条,质控后获得有效序列2.2ˑ107条,有效序列占比㊁Q20㊁Q30及GC含量均符合要求,数据可信(表1),可进行后续分析㊂2.2㊀人体肠道菌群组成分析总体来看,阿奇霉素对肠道菌群的Chao1㊁辛普森㊁香浓等指数影响不明显,Venn分析显示Con组特有微生物为310种,AZM组特有微生物为214种,2组共有微生物1052种㊂对全部样本有效序列进行注释分类,并分析相对丰度前20的类群㊂结果显示,发酵液中优势菌门为变形菌门(Proteobacte-ria)㊁厚壁菌门(Firmicutes)㊁放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes),这些菌门在Con组分别占46.7%㊁26.1%㊁16%和8.8%,在AZM组分别占66.5%㊁24.5%㊁3.5%和4.2%(图1(a))㊂与Con组的厚壁菌门和拟杆菌门比率相比,该比率在AZM组提高了约一倍㊂优势菌科为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)㊁表1㊀人体肠道菌群宏基因组测序数据Table1㊀Data of human gut microbiota by metagenome sequencingSamplesRaw Data Clean DataReads(107)Base/Gb Reads(107)Base/GbClean/%Q20/%Q30/%GC/%Con1 Con2 Con32.47.2 2.3 6.895.098.494.444 2.3 6.9 2.2 6.594.298.494.549 2.37.0 2.2 6.694.598.494.546AZM1 2.3 6.8 2.1 6.893.498.494.554 AZM2 2.27.2 2.2 6.494.198.494.343 AZM3 2.27.0 2.2 6.793.998.494.447注:Con表示对照,AZM表示阿奇霉素㊂Note:Con means control,and AZM means azithromycin.442㊀生态毒理学报第18卷图1　发酵液中肠道菌群的相对丰度注:(a)门水平组成,(b)科水平组成,(c)属水平组成,(d)种水平组成㊂Fig.1㊀Relative abundances of intestinal microbiota in fermentation brothNote:(a),(b),(c),and (d)means the composition of the microbiota in each group at the phylum,family,genus,and species level.新月形单胞菌科(Selenomonadaceae)㊁双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)和乳酸菌科(Lactobacillaceae)等,它们在Con 组分别占46.7%㊁16.8%㊁15.7%和6.2%,在AZM 组分别为66.4%㊁19.9%㊁3.5%和3%(图1(b))㊂优势菌属为埃希氏菌属(Escherichia ),巨单胞菌属(Megamonas )㊁双歧杆菌属(Bifidobacteri -um )㊁克雷伯氏菌属(Klebsiella )㊁Phocaeicola ㊁未定义细菌属(unclassified)㊁拟杆菌属(Bacteroides )和Ligi -lactobacillus 等,其中前4种菌属在Con 组分别占38%㊁16.8%㊁15.7%和7.5%,在AZM 组分别占56.1%㊁19.9%㊁3.5%和9.3%(图1(c))㊂优势种为大肠杆菌(Escherichia coli )㊁单形巨单胞菌(Megamonas funiformis )㊁肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia )㊁青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis )㊁假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum )㊁Pho -caeicola vulgatus ㊁瘤胃乳酸杆菌(Ligilactobacillus ru -minis )㊁Prevotella copri ㊁长双歧杆菌(Bifidobacterium longum )和超巨巨单胞菌(Megamonas hypermegale ),其中前4种菌种在Con 组分别占38%㊁15.9%㊁6.3%和0.2%,在AZM 组分别占56.1%㊁18.8%㊁8.1%和2.7%(图1(d))㊂对发酵液中的古菌㊁真菌和病毒进行分析,结果显示优势古菌为甲烷球形菌属(Methanosphaera )和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter )等,它们在Con 组分别占77.7%和11.1%,在AZM 组分别占75.5%和13.3%(图2(a))㊂优势真菌为酵母菌属(Saccharo -myces )㊁未分类真菌属(unclassified)㊁马拉色菌属(Malassezia )㊁念珠菌属(Candida )㊁假尾孢属(Pseudo -cercospora )㊁葡萄孢属(Botrytis )㊁Capronia 和德巴氏酵母菌(Debaryomyces ),其中前4种菌属在Con 组分别占45.9%㊁39.8%㊁低于1%㊁13.4%,在AZM 组分别占2.6%㊁低于1%㊁36.1%和16.7%(图2(b))㊂除去99%以上未分类病毒属后,优势病毒为Jiaoda -virus ㊁Webervirus ㊁Shamshuipovirus ㊁Wanchaivirus 和Uetakevirus 等(图2(c))㊂总之,阿奇霉素降低盐红菌属㊁酵母菌属和Webervirus 等的相对丰度,提高甲烷八叠球菌属㊁念珠菌属㊁马拉色菌属㊁假尾孢属㊁葡萄孢属和Jiaodavirus 等的相对丰度㊂第4期赵昌会等:阿奇霉素与人体肠道菌群体外相互作用的初步研究443㊀2.3㊀人体肠道菌群差异性分析菌群差异性分析显示,阿奇霉素显著降低双歧杆菌属(Bifidobacterium )㊁片球菌属(Pediococcus )㊁拟杆菌属(Bacteroides )㊁小杆菌属(Dialister )㊁理研菌属(Petrimonas )㊁乳酸杆菌属(Lactobacillus )㊁棒杆菌属(Corynebacterium )㊁乏养菌属(Abiotrophia )㊁Mixta 和欧文氏菌属(Erwinia )等的相对丰度;显著提高罗尔斯顿氏菌属(Ralstonia )和果胶杆菌属(Pectobacterium )的相对丰度(P <0.05)(图3(a))㊂种水平上阿奇霉素显著降低长双歧杆菌(Bifidobacterium longum )㊁乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici )㊁德氏乳杆菌(Lactoba -cillus delbrueckii )㊁Limosilactobacillus fermentum和链图2㊀发酵液中微生物在属水平上的相对丰度注:(a)古菌,(b)真菌,(c)病毒㊂Fig.2㊀Relative abundances of intestinal microbiota in fermentation broth at the genus levelNote:(a)Archaea,(b)Fungi,(c)Virus.图3㊀LEfSe 分析肠道菌群的差异显著性注:(a)属水平,(b)种水平㊂Fig.3㊀Differential abundance of intestinal microbiota taxa analyzed by LEfSeNote:(a)Genus level,(b)Species level.444㊀生态毒理学报第18卷状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum )等的相对丰度;显著提高小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia entero -colitica )和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii )的相对丰度(P <0.05)(图3(b))㊂2.4㊀人体肠道菌群KEGG 差异性分析肠道菌群生物学功能注释和分析结果显示,1级水平上新陈代谢途径丰度最高(接近75%);2级水平上前20代谢途径差异不明显;3级水平上有6条代谢途径差异显著(P <0.05),它们分别是新生霉素生物合成(novobiocin biosynthesis)㊁核黄素代谢(ribo -flavin metabolism)㊁昆虫激素生物合成(insect hor -mone biosynthesis)㊁长寿调节途径-蠕虫(longevity regulating pathway -worm)㊁蛋白质消化和吸收(pro -tein digestion and absorption)及脂肪细胞因子信号通路(adipocytokine signaling pathway)(图4)㊂与对照组相比,AZM 组昆虫激素生物合成降低了92.9%,蛋白质消化和吸收降低了88.6%,其余代谢途径变化幅度在10%~20%之间㊂图4㊀基于HUMAnN2对宏基因序列进行KEGG 功能预测注:代谢途径在KEGG 分类水平1(a)和水平2(b)上的相对丰度;水平3上显著差异代谢途径的相对丰度(c)㊂Fig.4㊀Predicted KEGG function differences based on metagenomic sequences using HUMAnN2Note:Relative abundance of metabolic pathways on KEGG categories at level 1(a)and level 2(b),relative abundancesof the significantly different pathways at level 3(c).第4期赵昌会等:阿奇霉素与人体肠道菌群体外相互作用的初步研究445㊀2.5㊀人体肠道菌群抗性基因差异性分析宏基因组测序结果显示,阿奇霉素显著降低ARO3003730(isoleucyl-tRNA synthetase,异亮氨酰tRNA合成酶)和ARO3003318(aminocoumarin resist-ance,香豆素抗性)的丰度(P<0.05);显著提高ARO 3002079㊁ARO3002117㊁ARO3002085和ARO 3002059(分别为CMY-66㊁CMY-105㊁CMY-72和CMY-48β-内酰胺酶)的丰度(P<0.05)(图5)㊂2.6㊀短链脂肪酸和阿奇霉素含量分析气相色谱检测及统计分析结果显示,阿奇霉素发酵液中的乙酸含量显著低于对照组(P<0.05),短链脂肪酸和丙酸的含量变化不明显(图6(a))㊂分光光度法检测结果显示,发酵液中阿奇霉素含量约为其初始含量的97%(图6(b)),仅降解了3%,说明人体肠道菌群对阿奇霉素的降解效率较低㊂2.7㊀肠道菌群与代谢途径㊁乙酸及抗性基因的相关性分析㊀㊀相关性分析结果(图7)显示,乙酸含量与双歧杆菌属㊁小杆菌属和Mixta等正相关,与罗尔斯顿氏菌属和果胶菌属负相关㊂ARO3003730(异亮氨酰tRNA图5㊀抗性基因差异分析Fig.5㊀The analysis of different antimicrobial resistancegenes图6㊀发酵液中的短链脂肪酸(SCFAs)(a)和阿奇霉素(AZM)(b)含量Fig.6㊀Contents of short-chain fatty acids(SCFAs)(a)and azithromycin(AZM)(b)in the fermentationbroth图7㊀肠道菌群与代谢途径㊁乙酸和抗性基因的相关性分析注:*r>0.8,P<0.05㊂Fig.7㊀The correlation of gut microbiota with KEGG pathway,acetic acid and antibiotic resistance genesNote:*r>0.8,P<0.05.446㊀生态毒理学报第18卷合成酶)和ARO3003318(香豆素抗性)与放线菌属㊁双歧杆菌属㊁理研菌属㊁乏养菌属和厌氧丁酸菌属等正相关㊂ARO3002079等β-内酰胺酶类抗性基因与放线菌属和厌氧丁酸菌属等负相关㊁与罗尔斯顿氏菌属和果胶菌属正相关㊂在代谢途径方面,核黄素代谢途径与放线菌属㊁双歧杆菌属和小杆菌属等负相关,而其余代谢途径与放线菌属㊁双歧杆菌属和小杆菌属等正相关㊂3㊀讨论(Discussion)体外模拟发酵表明阿奇霉素对人体肠道菌群结构影响显著㊂在门水平上,阿奇霉素与氯霉素[24]都提高变形菌门的相对丰度,不同之处是阿奇霉素还显著降低放线菌门的相对丰度,但与阿奇霉素降低婴幼儿肠道中变形菌门的相对丰度不同[25],可能是阿奇霉素对肠道菌群结构的影响存在年龄差异㊂本文发现阿奇霉素提高厚壁菌门与拟杆菌门的比率,降低乳酸杆菌㊁放线菌门和双歧杆菌属的相对丰度,这分别与动物实验[26]及临床实践[27]的结果类似㊂据报道阿奇霉素可改变小鼠肠道内Papillibacter㊁普氏杆菌属及梭菌属等的相对丰度[28],本文未发现此类情况,可能与人和小鼠间的肠道菌群差异有关㊂种水平上,阿奇霉素显著降低长双歧杆菌和单形巨单胞菌的相对丰度会提高患直肠癌风险[29],降低假小链双歧杆菌的相对丰度会诱发肠道炎症[30];阿奇霉素显著提高病原菌小肠结肠炎耶尔森菌和皮氏罗尔斯顿菌的相对丰度等也值得关注㊂特别是阿奇霉素对COVID-19感染治疗效果不佳[31],极有可能与其降低肠道益生菌的相对丰度有关,如重症新冠病毒患者肠道内益生菌的相对丰度显著降低[32],这提示我们使用阿奇霉素时需要注意其对人体肠道菌群结构的影响㊂此外,本文发现的阿奇霉素对肠道古菌㊁真菌及病毒群落结构的影响还需要进一步研究㊂总之,从肠道菌群结构变化看,长期服用阿奇霉素可能会对人体健康产生一定的毒副作用㊂药物影响肠道菌群结构的同时也会改变菌群的代谢产物和代谢途径㊂阿奇霉素显著降低乙酸含量,而乙酸含量与双歧杆菌属和小杆菌属的相对丰度正相关㊁与果胶杆菌属和罗尔斯顿氏菌属的相对丰度负相关,其中双歧杆菌属和小杆菌属与乙酸的相关性分别与临床实践[33]及模拟发酵结果相似[34],乙酸与其他微生物的相关性还要进一步验证㊂在代谢途径方面,总体上与前期研究结果类似[18],但阿奇霉素仅显著影响到6条代谢途径㊂其中阿奇霉素上调核黄素代谢途径可能有利于核黄素的合成,该途径在结直肠癌患者的肠道菌群中显著上调,主要涉及到脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)等[35],阿奇霉素上调核黄素代谢途径而降低双歧杆菌属和小杆菌属等的相对丰度可能会影响人体健康㊂阿奇霉素下调长寿调节途径-蠕虫可能会影响人类寿命,如Xi等[36]发现晚期非小细胞肺癌患者的寿命就与这条代谢途径正相关,该代谢途径还与双歧杆菌属和小杆菌属等正相关,这反映出阿奇霉素可能通过下调益生菌的丰度而影响人类寿命㊂阿奇霉素还下调脂肪信号因子途径㊁蛋白质消化和吸收途径㊁新生霉素生物合成途径及昆虫激素生物合成途径㊂其中脂肪信号因子途径上调可能有利于癌症的治疗,该途径与拟杆菌属及Tyzzerella等正相关[37],除拟杆菌属外,本文还发现脂肪信号因子途径与Pauljensenia㊁小杆菌属及Mix-ta等正相关㊂蛋白质消化和吸收途径主要涉及到宿主代谢,该代谢途径下调会导致体质量减轻[38],Wen 等[39]发现鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)与蛋白质消化和吸收途径正相关,这与本文发现Pauljensenia㊁棒杆菌属和双歧杆菌属等与该途径正相关的结果有所不同㊂新生霉素生物合成下调有益健康[40],与该代谢途径相关的微生物,以及昆虫激素生物合成途径在人体健康中的作用等还有待深入研究㊂抗性基因分析发现阿奇霉素提高肠道菌群的β-内酰胺酶抗性基因,该类基因主要存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌等革兰氏阴性菌中㊂本文发现阿奇霉素提高这些微生物的相对丰度,可能是它们的细胞中同时含有多种抗性基因,如β-内酰胺酶抗性基因和阿奇霉素抗性基因[41],推测同属于革兰氏阴性菌的罗尔斯顿氏菌属和果胶杆菌属的细胞中可能也含有这2种抗性基因,而Pauljensenia㊁双歧杆菌属㊁理研菌属和小杆菌属等细菌中可能缺乏相关抗性基因㊂异亮氨酰tRNA合成酶和香豆素抗性基因与放线菌属㊁双歧杆菌属㊁理研菌属㊁乏养菌属和厌氧丁酸菌属等正相关㊂其中异亮氨酰tRNA合成酶基因与双歧杆菌的耐药性相关[42],双歧杆菌属的丰度降低可能是双歧杆菌中的该酶对阿奇霉素敏感,而放线菌属和理研菌属等与异亮氨酰tRNA合成酶和香豆素抗性基因的相关性可能是其他抗性基因赋予的[43]㊂本文还发现高效液相色谱法无法定量检测发酵液中的阿奇霉素,用分光光度法[23]检测显示菌群的阿奇霉素降解率约为3%,这符合阿奇霉第4期赵昌会等:阿奇霉素与人体肠道菌群体外相互作用的初步研究447㊀素不易被降解的特性[44]㊂综上所述,阿奇霉素显著降低双歧杆菌属㊁小杆菌属和乳酸杆菌属等益生菌的相对丰度,提高果胶杆菌属和罗尔斯顿氏菌属等条件致病菌的相对丰度,并显著降低乙酸含量,阿奇霉素这种导致肠道菌群结构及其代谢的紊乱可能有损于人体健康㊂另外,阿奇霉素也会影响肠道古菌㊁真菌和病毒的群落结构㊂我们还注意到体外实验与临床实践存在一定差异,加上实验样本较少,因此,阿奇霉素暴露对人体肠道菌群的负面影响还需要进一步临床验证㊂通信作者简介:尹业师(1982 ),男,博士,教授,主要研究方向为微生物生态学㊂参考文献(References):[1]㊀Wang J Y,Xiong K,Zhao S L,et al.Long-term effects ofmulti-drug-resistant tuberculosis treatment on gut 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生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第4期2023年8月V ol.18,No.4Aug.2023㊀㊀基金项目:福建省自然科学基金资助项目(2020J01426);宁德师范学院中青年科研项目(2022ZQ101);宁德师范学院科技特派员科研资助专项(2022ZQ401)㊀㊀第一作者:李进寿(1965 ),男,教授,研究方向为生态毒理学,E -mail:***************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:***************DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221012001李进寿,陈懿娜,何亮银,等.丁草胺暴露对雄性褐菖鮋精细胞发育的干扰[J].生态毒理学报,2023,18(4):450-458Li J S,Chen Y N,He L Y ,et al.Exposure to butachlor disrupts development of sperm in male Sebastiscus marmoratus [J].Asian Journal of Ecotoxicolo -gy,2023,18(4):450-458(in Chinese)丁草胺暴露对雄性褐菖鮋精细胞发育的干扰李进寿1,2,3,*,陈懿娜1,4,何亮银1,2,3,郭团玉1,5,罗芬1,2,3,阮峻峰1,2,3,周逢芳1,2,31.宁德师范学院生命科学学院,宁德3521002.闽东水产品精深加工福建省高校工程研究中心,宁德3521003.国家海洋局海西海洋特色生物种质资源及生物制品开发公共服务平台,宁德3521004.福建省古田县松吉初级中学,古田3522005.厦门海洋职业技术学院,厦门361100收稿日期:2022-10-12㊀㊀录用日期:2022-12-12摘要:丁草胺是全球范围内使用最广泛的酰胺类除草剂之一㊂目前丁草胺对非目标生物的潜在毒性研究较多,但有关丁草胺对近海鱼类生殖毒性的研究鲜有报道㊂以近海鱼类褐菖鮋为研究对象,探讨丁草胺对海洋鱼类精细胞发育的影响及机制㊂以环境浓度(2㊁20和200ng ㊃L -1)的丁草胺对雄性褐菖鮋暴露50d 后,其精巢成熟精细胞数量下降,发育早期阶段的精原细胞与精母细胞数量上升,精巢雄激素睾酮(T)水平下降,Caspase -3活性上升,γ-谷酰胺转移酶(γ-GT)活性下降㊂相对荧光定量PCR 分析结果显示,促卵泡激素受体基因(FSHR β)与促黄体生成激素受体基因(LHR β)mRNA 表达量被抑制㊂这表明,丁草胺对雄性褐菖鮋有明显的生殖毒性,精巢支持细胞功能被抑制引起睾酮水平降低,进而导致精子发生被抑制㊂精巢细胞凋亡也是原因之一㊂关键词:丁草胺;褐菖鮋;生殖毒性;细胞凋亡;精细胞文章编号:1673-5897(2023)4-450-09㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AExposure to Butachlor Disrupts Development of Sperm in Male Sebastiscus marmoratusLi Jinshou 1,2,3,*,Chen Yina 1,4,He Liangyin 1,2,3,Guo Tuanyu 1,5,Luo Fen 1,2,3,Ruan Junfeng 1,2,3,Zhou Fengfang 1,2,31.College of Life Science,Ningde Normal University,Ningde 352100,China2.Engineering Research Center of Mindong Aquatic Product Deep -Processing,Ningde 352100,China3.Administration Hercynian Special Biological Germplasm Resources and Biological Product Development Public Service Platform,Ningde 352100,China4.Gutian Songji Junior High School of Fujian,Gutian 352200,China5.Xiamen Ocean V ocational and Technical College,Xiamen 361100,ChinaReceived 12October 2022㊀㊀accepted 12December 2022第4期李进寿等:丁草胺暴露对雄性褐菖鮋精细胞发育的干扰451㊀Abstract:Butachlor is one of the most widely used amide herbicides in the world.There are many studies on the possible toxic effects of butachlor on non-target organisms,but few studies addressing the reproductive toxicity of butachlor on offshore fishes are available.The present study was conducted to investigate the effects of butachlor on sperm development in Sebastiscus marmoratus and to gain insight into its mechanism.After exposed to buta-chlor at environmental concentrations(2,20,200ng㊃L-1)for50d,the development of sperm in testis was re-pressed in different extent,testosterone(T)was decreased in the testis,while the activities of Caspase-3were dose-dependently increased,and the activities ofγ-GT were dose-dependently decreased.Real-time PCR showed that the expression of FSHRβand LHβwere reduced in the testis.These results indicate that butachlor can cause significant reproductive toxicity to fish.The inhibited expression of FSHRβand LHRβresulted in decreased T levels in the testis and suppressed spermatogenesis.In addition,the apoptosis of testicular cells was another reason for the inhi-bition of spermatogenesis.Keywords:butachlor;S ebastiscus marmoratus;reproductive toxicity;apoptosis;spermatocysts㊀㊀随着现代农业科技的发展,人工合成的杀虫剂已成为最常见的污染源之一[1]㊂20世纪80年代有机氯及有机磷等高毒性农药被逐步淘汰后,三唑类㊁除虫聚酯类与酰胺类等人工合成的相对毒性较低的农药被大量使用㊂其中,酰胺类是亚洲使用最广泛的除草剂[2],仅在我国每年消耗量即在8000t以上[3],且使用量呈逐年攀升的趋势㊂这些药物在使用过程中除了少量作用于靶生物外,更多的药物残留通过农田废水污染了河流与湖泊等淡水水域,且通过江河等汇集于近海海域㊂例如,Mamun等[4]的报道显示在日本一些地区地表水丁草胺(butachlor)的浓度达到0.1~1.4μg㊃L-1,欧美国家的调查也显示,包括甲草胺㊁乙草胺㊁丁草胺及乙丙甲草胺在内的多种酰胺类检出浓度达0.022~3.68μg㊃L-1[5-8],在中国,华北地区与淮河水域地表水中乙草胺的最高检出浓度分别为1.64μg㊃L-1与2.0μg㊃L-1[9-10]㊂而酰胺类除草剂对近海水域的污染方面,黄群腾[11] 2007年在我国福建省九龙江口及厦门近海海水检测到乙草胺㊁丁草胺及异丙甲草胺等多种酰胺类的物质,其中丁草胺浓度达到16.7~104.9ng㊃L-1㊂丁草胺是目前国内农田使用最广泛的三大除草剂之一[3],广泛用在作物出苗前或出苗后早期阶段以防治各种有害杂草[12],仅在在亚洲每年的使用量就达到4500t[13]㊂有关丁草胺对水生生物的毒副作用,已有报道显示对蚯蚓(Eisenia fetida)[14]㊁水蚤(Daphnia carinata)[15]㊁姬蛙(Microhyla)蝌蚪[16]㊁泽蛙(Fejervarya limnocharis)[17]等土壤与水生动物均存在毒性㊂对鱼类,乙草胺可导致泥鳅(Misgurnus an-guillicaudatus)血红细胞的变异[18],斑马鱼(Danio re-rio)胚胎以4~20mmol㊃L-1浓度梯度的丁草胺暴露84h后,胚胎孵化过程受到阻碍且出现畸形和死亡,胚胎雌激素应答基因(Vtg1)表达被显著诱导[19],斑马鱼在25㊁50和100μg㊃L-1浓度的丁草胺中暴露30d后,其繁殖力出现降低,雄性性体比(GSI)指数在50μg㊃L-1和100μg㊃L-1浓度组显著下降,雌性斑马鱼在100μg㊃L-1浓度组血浆睾酮(T)和17-雌二醇(E2)水平出现显著下降[20],Ateeq等[21]的研究则显示丁草胺可引起雄性鲶鱼(Clarias batrachus)精巢小叶支持细胞出现大量凋亡而降低繁殖力㊂以上有关丁草胺对鱼类的毒性研究主要针对的是淡水鱼类,但未见对近海鱼类毒性研究㊂由于丁草胺等酰胺类除草剂在土壤㊁地下水与地表水体均被检测到,且在近海海域有较严重的污染,因此该类农药对近海鱼类的毒性研究具有重要的现实意义㊂本实验参照黄腾群[11]对九龙江口及厦门近海水体环境浓度的检测结果,设置2㊁20㊁200ng L-1浓度梯度的丁草胺对我国东南沿海常见的经济鱼类褐菖鮋(Sebastiscus marm-oratus)进行50d的慢性水体暴露,以调查该类除草剂对海洋鱼类的生殖毒性㊂本研究对除草剂等人工合成的农药在使用过程中对水环境造成的生态风险的评估以及规范使用相关农药具有一定意义㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀药品丁草胺(标准品,纯度ȡ95%,产品货号: B114549),购自上海泽叶生物科技有限公司㊂1.2㊀褐菖鮋的驯化和暴露处理及样品的收集试验用鱼参照李进寿等[22]的方法进行驯化和暴露㊂驯化实验:褐菖鮋为霞浦县溪南镇七星村海域购得的海捕鱼,雄鱼大小规格(67.62ʃ3.58)g;驯化期452㊀生态毒理学报第18卷间每天定时定量投喂饵料,且定期观察摄食情况及水质变化;驯化前将砂滤海水用预先经过24h曝气的淡水将盐度调整为22~24,驯化时间7d㊂暴露实验:暴露实验以乙腈溶剂对照组㊁低浓度2ng㊃L-1组㊁中浓度20ng㊃L-1组和高浓度200ng㊃L-1组的浓度梯度分4缸进行,200ng㊃L-1㊁20ng㊃L-1和2ng㊃L-1的药物组分别加入200μL预先用乙腈为溶剂配制的60.00㊁6.00㊁0.60ng㊃μL-1的丁草胺应用液,对照组加入等量体积(200μL)的乙腈溶剂,并立即将缸内实验水体混匀㊂暴露实验过程每天在大致相同的时间将暴露用实验海水更换1/2(30L),同时补充1/2剂量的丁草胺药物㊂大约在每天换水前2h,按照褐菖鮋体质量2%~3%的比例投喂鱼配合饲料,换水过程用虹吸管清除水缸底部的鱼粪和未摄食的饲料残饵㊂实验过程中每隔7d将水缸清洗干净且全部更换暴露用水及丁草胺药物,暴露实验时间为50d㊂暴露实验期间需要利用增氧设备对各缸水体进行不间断充气以保证实验水体的供氧充足㊂暴露实验结束进行采样,用于生化指标测定的试验样品置于-20ħ的冰柜中备用;分子实验的样品放在-80ħ超低温冰箱保存等待检测;用于组织学观察的褐菖鮋精巢组织以饱和的三硝基苯酚溶液固定保存于4ħ冰箱,并在隔夜后更换新的三硝基苯酚固定液㊂杀鱼取样时对各暴露组所有鱼的精巢㊁肝脏和体质量进行称量,以检测各暴露组性体比指数(GSI)和肝体比指数(HSI)㊂1.3㊀组织学分析将饱和三硝基苯酚固定的褐菖鮋精巢经流水清洗过夜后以梯度浓度的乙醇㊁正丁醇进行脱水㊁透明与透蜡处理后以石蜡包埋方式制作切片,在切片机上以4μm厚度切片㊂切片采用苏木精和伊红(H.E.)染色后,镜检对照组及各暴露组精细胞的发育状况㊂脱水步骤:以V(正丁醇)ʒV(无水乙醇)ʒV(水) =20ʒ50ʒ30的溶剂处理2h;以V(正丁醇)ʒV(无水乙醇)ʒV(水)=45ʒ45ʒ10的溶剂处理2h;以V (正丁醇)ʒV(无水乙醇)=75ʒ25的溶剂处理2h;以V(正丁醇)ʒV(无水乙醇)=85ʒ15的溶剂处理1 h;以V(正丁醇)ʒV(无水乙醇)=95ʒ5的溶剂处理1h;以正丁醇处理1h,正丁醇处理1h,正丁醇处理1h(共处理3次)㊂透明:正丁醇和石蜡各半的混合液处理30min㊂透蜡:石蜡Ⅰ透蜡1h,石蜡Ⅱ透蜡1h㊂1.4㊀精巢半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性的测定褐菖鮋精巢组织先进行匀浆处理,以事先经过预冷且pH调整为7.4的磷酸缓冲液为匀浆液,匀浆后在4ħ条件下以2000r∙min-1速度离心5min 后取精巢组织上清液用于测定Caspase-3活性㊂Caspase-3活性用Caspase试剂盒(Keygene Biotech Co.,Ltd.,中国南京)按照说明书提供的方法测定㊂暴露组样品Caspase-3活性均需调整为等蛋白浓度后与对照组比较分析㊂样品蛋白质浓度以Brad-ford[23]的方法测定,蛋白测定时以牛血清蛋白为标准㊂1.5㊀精巢γ-谷酰胺转移酶(γ-GT)活性的测定γ-GT活性测定时精巢组织的处理同Caspase-3活性测定的方法,γ-GT活性按照γ-GT试剂盒(Key-gene Biotech Co.,Ltd.,中国南京)说明书的方法进行测定㊂γ-GT的单位为U∙g-1,试验条件下15min 产生1μmol的底物定义为1个酶活单位㊂1.6㊀精巢雄性激素睾酮(T)水平的测定睾酮(T)水平以Sun等[24]的方法测定㊂测定前每个精巢组织以m(精巢)ʒm(乙醇)=1ʒ9的比例在冰浴条件下匀浆㊂匀浆后的样品在-80ħ超低温至少保存24h,再用3mL的乙酸乙酯萃取3次㊂萃取物置入5mL离心管内,用在氮吹仪下吹干后加入0.5mL缓冲液㊂T水平的测定采用放射性免疫方法使用试剂盒按照使用说明书测定(北京福瑞生物工程公司)㊂T检测限为0.1~30nmol㊃L-1;批间极差12‰㊂1.7㊀相对定量PCR(real-time PCR)的分析褐菖鮋精巢总RNA用试剂盒提取,cDNA亦用试剂盒反转录㊂总RNA的浓度与纯度的测定用Nanodrop ND-1000分光光度计测定,CYP-19s基因的cDNA片段以笔者此前的方法[22]扩增㊂褐菖鮋靶基因CYP-19s㊁FSHRβ与LHRβ的cDNA片段采用Sun等[25]的方法进行扩增㊂基因mRNA表达的测定也采用Sun等[25]的方法㊂基因相对表达量计算软件(REST-MCS®-version2)用于靶基因mRNA 相对表达量的计算㊂靶基因CYP-19a引物序列为F:5 -GCAGTGCGTGTTGGAGATG-3 ,R:5 -CT-GCTGCGACAGGTTGTTG-3 ;CYP-19b引物序列F:5 -GCTGAGGATAGTGGAGGAGATG-3 ,R:5 -GACCGATGTTGAGAATGATGTT-3 ;FSHRβ引物序列F:5 -TGGTTGTCATGGCAGCAGTG-3 ,R: 5 -GTGGTGTCGATGAATTGGGTT-3 ;LHRβ引物序列F:5 -AGAAGGAGGGCTGTTCCAAGT-3 ,第4期李进寿等:丁草胺暴露对雄性褐菖鮋精细胞发育的干扰453㊀5 -ATGATGCTGTTGTAGGTGGT -3 ㊂1.8㊀数据处理实验结果以SPSS11.0软件进行单因素方差分析(ANOV A),若P <0.05则为显著性差异,各组数据以平均值ʃ标准偏差(mean ʃSD)表达㊂2㊀结果(Results )2.1㊀性体比(GSI)㊁肝体比(HSI)变化如图1所示,褐菖鮋在丁草胺各个浓度暴露组与对照组间GSI 与HSI 均未观察到显著性差异(P >0.05)㊂2.2㊀褐菖鮋精巢细胞发育的组织学切片观察雄性褐菖鮋经过不同浓度的丁草胺暴露50d后的精巢细胞发育的组织学变化如图2所示,从图2中可以观察到随着药物浓度的升高,精巢成熟精子(SP)数量呈减少趋势㊂同时从组织学切片可以观察到精巢由不同的精巢小叶,每个小叶内含有处于不同发育阶段的精细胞,包括在发育早期阶段的精原细胞(SG)㊁精母细胞(SC)以及成熟精子㊂每个暴露组随机取3个不同的精巢分析统计各期生殖细胞的平均百分比,结果显示各暴露组SG 与SC 占比与对照组相比出现上升,其中SG 在中浓度的20ng ㊃L -1组与高浓度的200ng ㊃L -1出现显著性升高,而SC 在各个浓度组均出现显著性升高,而SP 的占比则较对照组出现下降,其中20ng ㊃L -1组与200ng ㊃L -1组精巢中SP 比例显著低于对照组(图3)㊂2.3㊀褐菖鮋精巢雄性激素睾酮(T)的变化如图4所示,褐菖鮋在丁草胺暴露50d 后,各浓度暴露组的雄性激素睾酮(T)水平呈现丁草胺浓度依赖式的下降趋势,且全部显著低于对照组(P<0.05)㊂2.4㊀褐菖鮋精巢Caspase -3活性的变化经过丁草胺暴露50d 后褐菖鮋精巢Caspase -3的活性变化如图5所示,精巢Caspase -3活性变化与丁草胺呈浓度依赖性增强趋势,其中的20ng ㊃L -1组和200ng ㊃L -1组均较对照组出现显著性增强(P<0.05),但2ng ㊃L -1组Caspase -3活性升高不显著(P >0.05)㊂2.5㊀褐菖鮋精巢γ-GT 活性的变化如图6所示,褐菖鮋经丁草胺暴露50d 后,其精巢γ-GT 活性与丁草胺浓度呈负相关性变化趋势,其中200ng ㊃L -1组γ-GTP 活性显著低于对照组(P<0.05)㊂2.6㊀褐菖鮋精巢相关基因表达量的变化如图7所示,褐菖鮋在丁草胺暴露50d 后,其精巢芳香化酶基因(CYP -19a ㊁CYP -19b )㊁促卵泡激素受体基因(FSHR β)与促黄体生成激素受体基因(LHR β)mRNA 表达量均表现出对丁草胺的浓度依赖性下降趋势,其中CYP -19a 基因表达量在中浓度的20ng ㊃L -1组和高浓度的200ng ㊃L -1组均出现显著性下降(P <0.05);CYP -19b 基因的表达量在低浓度的2ng ㊃L -1组与中浓度的20ng ㊃L -1组下降不显著(P >0.05),高浓度的200ng ㊃L -1组表达量有显著性下图1㊀雄性褐菖鮋在丁草胺暴露50d 后性体比(GSI )和肝体比(HSI )的变化注:数据用平均值ʃ标准偏差(means ʃSD)表达(n =25);实验数据用单因素方差分析和Duncan 分析检验,不同字母表示差异显著P <0.05,相同字母表示差异不显著P >0.05㊂Fig.1㊀The gonadosomatic index (GSI)and hepatopancreas somatic index (HSI )changes of maleS.marmoratus in butachlor exposure for 50dNote:Data are presented as means ʃSD (n =25);means of exposures not sharing a common letter are significantly different at P <0.05,and sharing a common letter are not different at P >0.05,as assessed by One -way ANOV A followed by the Dunnett s test.454㊀生态毒理学报第18卷图2㊀丁草胺暴露50d后雄性褐菖鮋精巢的组织学变化切片图注:(a)对照,(b)2ng㊃L-1,(c)20ng㊃L-1,(d)200ng㊃L-1;标尺为50μm;SG为精原细胞,SC为精母细胞,SP为成熟精子细胞㊂Fig.2㊀Histological changes of the testes stained with hematoxylin and eosin in male S.marmoratus exposed to butachlor for50dNote:(a)Control;(b)2ng㊃L-1;(c)20ng㊃L-1;(d)200ng㊃L-1;Bar=50μm;SC,spermatocytes;SG,spermatogonia;SP,sperm.图3㊀雄性褐菖鮋经过丁草胺暴露50d后各阶段精细胞百分比的变化注:SG为精原细胞,SC为精母细胞,SP为成熟精子细胞;数据用平均值ʃ标准偏差(meansʃSD)表达(n=3);实验数据用单因素方差分析和Duncan分析检验,不同字母表示差异显著P<0.05,相同字母表示差异不显著P>0.05㊂Fig.3㊀Percentage of spermatocysts at different stages of development in male S.marmoratus exposed to butachlor for50d Note:SG,spermatogonia;SC,spermatocytes;SP,sperm;the data are expressed as meansʃSD(n=3);means of exposures notsharing a common letter are significantly different at P<0.05,and sharing a common letter are not different at P>0.05,as assessed by One-way ANOV A followed by the Dunnett stest.图4㊀雄性褐菖鮋经丁草胺暴露50d后精巢雄性激素睾酮(T)的变化注:实验数据用平均值ʃ标准偏差(meansʃSD)表示(n=6);组间多重数据比较采用单因素方差分析和Duncan分析检验,不同字母表示差异显著P<0.05,相同字母表示差异不显著P>0.05㊂Fig.4㊀The content of testosterone(T)in the testis of male S.marmoratus exposed to butachlor for50dNote:Data are presented as meanʃSD(n=6);means ofexposures not sharing a common letter aresignificantly different at P<0.05,and sharing a commonletter are not different at P>0.05,as assessedby One-way ANOV A followed by the Dunnett s test.第4期李进寿等:丁草胺暴露对雄性褐菖鮋精细胞发育的干扰455㊀图5㊀雄性褐菖鮋在丁草胺暴露50d 后精巢Caspase-3活性的变化注:实验数据用平均值ʃ标准偏差(means ʃSD)表示(n =5~6);组间多重数据比较采用单因素方差分析和Duncan 分析检验,不同字母表示差异显著P <0.05,相同字母表示差异不显著P >0.05㊂Fig.5㊀Caspase -3activities in the testis of male S.marmoratusexposed to butachlor for 50dNote:Data are presented as mean ʃSD (n =5~6);means of exposures not sharing a common letter are significantly different at P <0.05,and sharing a common letter are not different at P >0.05,as assessedby One -way ANOV A followed by the Dunnett stest.图6㊀丁草胺暴露50d 后雄性褐菖鮋精巢γ-GT 的活性变化注:实验数据用平均值ʃ标准偏差(means ʃSD)表示(n =6);组间数据比较采用单因素方差分析和Duncan 分析检验,不同字母表示差异显著P <0.05,相同字母表示差异不显著P >0.05㊂Fig.6㊀γ-GT activities in the testis of maleS.marmoratus exposed to butachlor for 50dNote:Data are presented as mean ʃSD (n =6);means of exposures notsharing a common letter are significantly different at P <0.05,and sharing a common letter are not different at P >0.05,as assessedby One -way ANOV A followed by the Dunnett s test.降(P<0.05);FSHR β基因的表达量在高浓度的200ng ㊃L -1组显著性下降;LHR β基因的表达量在中浓度的20ng ㊃L -1组与高浓度的200ng ㊃L -1组均显著性下降(P <0.05)㊂3㊀讨论(Discussion )在鱼类生殖毒性的研究中,人工合成的除草剂[26]㊁杀虫剂[22,27]等农药是热点之一,这些报道均表明这些低毒性农药对近海鱼类具有明显的生殖毒性㊂而酰胺类农药对淡水水域水生生物的毒性也已有诸多报道㊂He 等[15]报道丁草胺对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus )的96h -EC 50为2.31mg ㊃L -1,对隆线蚤(Daphnia carinata )的48h -EC 50为3.40mg ㊃L -1,显示丁草胺对这2种浮游生物均具有中等毒性㊂在鱼类中,Xiang 等[28]报道以1㊁2㊁5㊁10㊁15μmol ㊃L -1浓度梯度的丁草胺对斑马鱼(Danio rerio )暴露72h 后,其胚胎死亡率和畸形率均出现升高,且与丁草胺呈剂量依赖性上升趋势㊂Chang 等[20]报道雌性斑马鱼在25㊁50和100μg ㊃L -1浓度的丁草胺暴露30d 后,HSI 无显著变化,雄鱼GSI 在50μg ㊃L -1和100μg ㊃L -1浓度组出现显著性下降,雌雄鱼血浆睾酮(T)㊁17-雌二醇(E2)㊁血浆甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)水平及VTG 水平等出现不同程度的上升或下降㊂这些报道均表明丁草胺对斑马鱼具有明显的生殖毒性,并可导致内分泌系统的紊乱㊂然而,有关酰胺类除草剂对近海鱼类的生殖毒性却未见报道,因此开展酰胺类除草剂对近海鱼类的潜在毒性研究具有现实的意义㊂在本实验中,尽管丁草胺暴露未导致褐菖鮋GSI 与HSI 出现显著性变化,但组织学观察的结果表明丁草胺的暴露引起雄性褐菖鮋性腺精细胞的发育被抑制,体现为成熟精子(SP)数量大量减少,而处于发育早期的精原细胞(SG)与精母细胞(SC)却显著增加㊂环境毒物对鱼类GSI 的影响方面,或许与水域盐度相关㊂Chang 等[20]报道雄性斑马鱼在25㊁50和100μg ㊃L -1的丁草胺中暴露30d 后,GSI 在50μg ㊃L -1和100μg ㊃L -1浓度组出现显著性下降的现象㊂Forsgren 等[29]的报道也指以0.1μg ㊃L -1与1.5μg ㊃L -1浓度的联苯菊酯对雄性虹鳟鱼(Oncorhyn -chus mykiss )进行水体暴露14d 后其GSI 无显著变化,但雌性虹鳟鱼GSI 则有显著性下降㊂鱼类精巢由数量极多的精巢小叶组成,其壁上的支持细胞是支持精子发育的营养通路,因此支持细胞在精子发育过程中起到关键作用[30]㊂而在鱼类精巢的发育过456㊀生态毒理学报第18卷程中,γ-谷酰胺转移酶(γ-GT)对维持支持细胞的活性具有重要作用,因此γ-GT 活性是检验支持细胞功能的重要标记物[30-31]㊂在本研究中,褐菖鮋精巢γ-GT 活性的下降说明丁草胺的暴露导致精巢支持细胞功能降低,研究中FSHR β㊁LHR β基因表达量的下降也证明精巢支持细胞功能降低,因为FSH 激素与LH 激素在精巢支持细胞的增殖过程中均起到决定性的作用[32]㊂图7㊀雄性褐菖鮋在丁草胺暴露50d 后精巢相关基因mRNA 表达量的变化注:基因的相对表达量以β-actin 为内参;实验数据用平均值ʃ标准偏差(means ʃSD)表示(n =4~6);组间多重数据比较采用单因素方差分析实验数据用单因素方差分析和Duncan 分析检验,不同字母表示差异显著P <0.05,相同字母表示差异不显著P >0.05㊂Fig.7㊀Relative mRNA expression of related gene of the testis in male S.marmoratus exposed to butachlor for 50dNote:Values were normalized against β-actin;the data are presented as mean ʃSD (n =6);means of exposures not sharing acommon letter are significantly different at P <0.05,and sharing a common letter are not different at P >0.05,as assessed by One -way ANOV A followed by the Dunnett s test.㊀㊀在动物机体内,为维持体内环境的稳定,不同组织的细胞凋亡是普遍现象,涉及到组织的修复与重塑等过程[33-35]㊂在此过程中,Caspase 家族酶在激活细胞凋亡通道方面担负主要功能,其中Caspase -3是最关键的酶之一[36]㊂本实验结果显示,褐菖鮋在丁草胺暴露后精巢中Caspase -3活性增强,这表明丁草胺的暴露加剧褐菖鮋睾丸精细胞的凋亡㊂已有研究表明环境毒物如重金属镉[37]㊁壬基酚(nonylphenol)与槲皮素(quercetin)等[38]诱导引起的细胞凋亡都可成为影响性腺发育的重要原因,因为这会引起大量精细胞在发育早期出现凋亡,必然导致成熟精子数量大量减少,精巢组织学分析结果也证明了这一点㊂在本研究中,丁草胺的暴露导致了褐菖鮋精巢细胞色素P450芳香化酶(CYP -19s )基因的表达被抑制,这是因为环境有毒物质会影响CYP -19s 基因表达量的变化[39]㊂硬骨鱼类下丘脑-垂体-性腺轴(hypo -thalamic -pituitary -gonadal axis,HPG)是调节性腺发育的主要内分泌系统[26-27],而环境毒性物质可通过抑制脑垂体FSH β与LH β基因的表达[40-41],从而减少FSH 激素与LH 激素的分泌㊂FSH 激素与LH 激素,在雄性鱼类中对精巢小叶维持支持细胞的功能具有重要作用[42],精巢小叶支持细胞功能的下降导致精细胞发育受阻是引起成熟精子数量减少的内在机制㊂研究中褐菖鮋精巢FSHR β与LHR β表达受到抑制而引起精巢睾酮分泌减少,而睾酮含量的下降是精细胞发育被抑制的原因之一,因为鱼类性腺性激素水平在调节性腺发育的过程起重要作用[24]㊂综上所述,丁草胺的暴露引起精巢中γ-GT 活性下降,说明支持细胞受到损伤,进而导致精巢FSHR β与LHR β表达下调,导致睾酮水平下降,抑制了精子发生㊂Caspase -3活性增强促使精巢细胞发生凋亡,是导致成熟精子数量大量减少的另一个原因㊂第4期李进寿等:丁草胺暴露对雄性褐菖鮋精细胞发育的干扰457㊀参考文献(References):[1]㊀程艳红,葛婧,胡高洁,等.3种酰胺类除草剂对斑马鱼不同生长阶段的急性毒性效应[J].生态毒理学报, 2017,12(6):171-178Cheng Y H,Ge J,Hu G J,et al.Acute toxicity effects ofthree amide herbicides to different life stages of zebrafish(Danio rerio)[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2017, 12(6):171-178(in Chinese)[2]㊀Kumari N,Narayan O P,Rai L C.Understanding buta-chlor toxicity in Aulosira fertilissima using physiological,biochemical and proteomic approaches[J].Chemosphere, 2009,77(11):1501-1507[3]㊀Yu Y L,Chen Y X,Luo Y M,et al.Rapid degradation ofbutachlor in wheat rhizosphere soil[J].Chemosphere, 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• 切尔诺贝利核污染事件
• 1986年原苏联基辅地区的切尔诺贝利核电站反应堆爆炸，大量放 射性物质外泄，上万人受到辐射伤害，直接死亡31人，13万居民 被疏散，污染范围波及邻国，核尘埃遍布欧洲。
现代文明
必需研究环境毒物
及其影响 并进行治理
环境毒理学、ห้องสมุดไป่ตู้态毒理学、污染生态学
环境毒理学
• 是从医学及生物学的角度，利用毒理学方法 研究环境中有害因素对人体健康影响的学科。 • 其主要任务是研究环境污染物质对机体可能 发生的生物效应，作用机理及早期损害的检 测指标，为制定环境卫生标准做好环境保护 工作提供科学依据。
• 研究毒物在生态系统中的效应和归宿的科学。
• Jorgensen (1990): the science of toxic substances in the environment and their impact on living organisms.
• 环境中有毒物质及其生物效应的科学。
• Suter (1993): the study of toxic effects on nonhuman organisms, populations, and communities.
现代毒理学学科体系
划分依据 生物学分类 研究手段 应用目标 学科 动物毒理学、植物毒理学、昆虫毒 理学等 生化毒理学、分子毒理学、免疫毒 理学等 生态毒理学、环境毒理学、药物毒 理学、农药毒理学、法医毒理学、 军事毒理学等
医学与损伤部 神经毒理学、生殖毒理学、发育毒 位 理学、血液毒理学、肝脏毒理学等
• 研究化合物对非人生物、种群和群落毒效的科学。
• Shane (1994): the study of the fate and effect of a toxic compound on an ecosystem.