一种验证SPR传感器金膜表面固定蛋白质分子有效性的简易途径
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第２ｌ卷第９期 ２００８年９月
传感技术学报
ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＥＮＳＯＲＳ ＡＮＤ ＡＣＴＵＡＴＯＲＳ Ｖ０１．２１ Ｎｏ．９
Ｓｅｐｔ．２００８
Ｓｉｍｐｌｅ Ｗａｙ ｔｏ Ｖａｌｉｄａｔｅ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ Ｇｏｌｄ Ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎ ＳＰＲ Ｓｅｎｓｏｒ
ＬＩＵＧｕｏ—ｈｕａ ，ＬＪ Ｚｈｉ—ｌｉａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉ，ＪＩＮ Ｈａｏ—ｙｕ， ＪＩＡＮＧＰｉｎｇ。ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ，ＹＡＮＧ Ｓｉ—ｙｉ，Ｎ，ＵＷｅｎ—ｃｈｅｎｇ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｒｒｍｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｇｏｌｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｓ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓｕｒ— ｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｅｎｓｏｒｓ．Ｉｔ ｉｓ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｈｏｗ ｔｏ ｖａｌｉｄａｔｅ ｔｈａｔ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｏｌｄ ｓｕｒｆａｃｅ．Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（ＩｇＧ－ＨＲＰ）ａｓ ａ ｆｌａｇ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．Ｉｆ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉｔ ｃａｎ ａｌｓｏ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ ｇｏｌｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｓ ｔｒｅａ— ｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＴＭＢ ａｎｄ Ｈ２ Ｏ２．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃａｎ ｔｅｌｌ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ ＳＵＣ— ｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈａｔ ｍｅｔｈｏｄ ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｅｒｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＨＣ１，ｔｈｅｒｅ ｗｉｌｌ ｂｅ ａ ｐｅａｋ ａｔ ４５０ｎｍ ｉｆ ｔｈｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ ｉｓ ｉｎｄｅｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ．Ｏｎｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｗａｙ．Ａｎｔｉ—ＩｇＧ ｗａｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｔｅｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｗａｓ ｓａｔｉｓｆｉｅｄ ａｆ— ｔｅｒ ｔｈｅ ＩｇＧ ｗａｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｅｎｓｏｒ；ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ＥＥＡＣＣ：７２３０Ｊ
一种验证ＳＰＲ传感器金膜表面固定 蛋白质分子有效性的简易途径 ＊
刘国华 ，李智梁，张 维，靳昊宇，姜 平，王 程，杨锶毅，牛文成 （南开大学信息技术科学学院，天津３０００７１）
摘 要：利用表面等离子共振传感器进行免疫检测的实验中，需要在化学性质稳定的金膜表面固定蛋白质分子探针。如何 验证一种方法是否能够成功固定蛋白质分子具有非常重要的现实意义。提出的验证方法采用酶反应作为标志，如果某种方 法确实能有效固定蛋白质分子，那么它也能固定酶。将固定好酶的金膜浸入相应的底物溶液中发生变色反应，测量底物溶液 的吸收光谱，即可根据结果判断是否有效固定了酶，同时达到判断这种方法是否可固定蛋白质的目的。具有快速、方便、低成 本等优点。采用经过验证的方法固定抗ＩｇＧ后通入ＩｇＧ，实验响应良好。 关键词：表面等离子共振传感器；验证蛋白质固定方法；酶反应 中图分类号：ＴＰ２１２．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１ＯＯ４—１６９９（２Ｏ０８）Ｏ９－１４７７－Ｏ４
表面等离子体共振（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＳＰＲ）生物传感器是分子生物学信息分析检测最重要 的技术之一。它能实时反映生物分子相互作用的过 程，而不同于其他只能提供生物分子作用后的结果的 方法，有助于研究反应的机理和动态特征Ｅ 。 将ＳＰＲ传感器用于免疫学检测需要在金膜上 固定蛋白质分子。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ等人提出了固定蛋白 质分子的基本方法【２］，Ｌｏｆａｓ等人在此基础上也做 了大量的研究工作ｌ３ ］，使得目前可以利用ＳＰＲ传 感器完成蛋白质分子的定性甚至定量检测；然而，蛋 白质分子的固定经常会受到多种因素的影响，因此 如何验证在金膜表面固定蛋白质分子的有效性是免 疫检测实验中必须面对的问题。 验证金膜表面固定蛋白质分子的有效性，实际
基金项目：国家自然科学基金资助（６０５７４０９１）；天津市科技攻关项目资助（０６ＹＦＥｔ￣Ｘ０８７００）；天津市自然科学基金资助（ｏｓＪＣＹＢＩＣ１２５０ｏ） 收稿日期：２ｏ０７—０５—１９ 修改日期：２００８—０７一Ｏ１ １４７８ 传感技术学报 ２００８皇 上就是设法检测金膜表面是否有蛋白分子的存在。 常用的检测方法有： ①颜色反应。即用米伦反应、茚三酮反应等蛋白 质的颜色反应来证实蛋白质分子的存在。由于在金膜 表面最多只能固定一个蛋白质分子层，即反应物很少， 因此这种方法的检测结果并不明显，灵敏度很低。 ②紫外分光光度法。其原理是蛋白质的肽键 在２００～２５０ ｎｍ的波长范围内有强的紫外吸收。 选用２１５ ｎｍ和２２５ ｎｍ光吸收差法，可减少非蛋白 质成分引起的误差。这种方法同样只适合检测较大 量蛋白质分子，不能满足检测金膜上微量蛋白质分 子需要。 ③酶联免疫吸附法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕ— ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）＿５ｊ。Ｅｌｉ ＳＡ是基于抗原 或抗体与酶形成的酶结合物能吸附至固相载体的表 面，并保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理的 一种方法。利用抗原与酶标抗体结合而固定酶，加 入酶反应的底物，底物被酶催化反应变为有色产物， 根据颜色反应的深浅进行定性、定量分析。由于这 个方法利用了酶的催化反应原理，少量的酶即可催 化大量底物分子发生化学反应，而其它方法则仅仅 是直接围绕微量的蛋白质分子的物理化学性质展 开，所以ＥＬＩＳＡ是上述方法中相对较好的一种方 法。然而，这种方法存在着操作程序复杂，检测周期 较长的缺陷。 ④快速斑点渗滤法。若其标记物质用胶体金 则称为快速斑点免疫金渗滤法（Ｄｏｔ—ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）ｌ＿６］或滴金免疫法。其基本原理仍是 间接法或夹心法，但使用的是金标记，而不是酶标 记。快速斑点免疫金渗滤法在操作完成后即可观察 结果，因此它克服了ＥＩ ＪＳＡ方法的不足，满足了快 速检测的需要；但是金膜会对胶体金的分辨带来不 利影响，容易造成误判。 鉴于上述方法存在的不足，本文提出了一种更 加简单有效的方法。其基本原理是采用酶反应作为 标志，如果某种方法确实能有效固定蛋白质分子，那 么它也能固定酶。将固定好酶的金膜浸入相应底物 的溶液中发生变色反应，测量底物溶液的吸收光谱， 即可根据结果判断是否有效固定了酶，同时达到判 断这种方法是否可有效固定蛋白质分子的目的。 １ 实验 １．１实验仪器与试剂 仪器：ＴＵ１９０１紫外可见光分光光度计，普析通用。 试剂：巯基十一烷醇、表氯醇、二甘醇二甲醚、溴 乙酸、ＮＨＳ（￣Ｌ京舒伯伟化工仪器有限责任公司）； 葡聚糖ＴＳＯＯ（上海达瑞精细化学品有限公司）；ＥＤＣ （上海生工生物工程技术服务有限公司）；乙醇胺、无 水乙醇（天津市光复精细化工研究所）；人ＩｇＧ、羊 抗人ＩｇＯ、ＨＲＰ标记的人ｉｇＯ、四甲基联苯胺ＴＭＢ （北京骏腾兴业生物科技有限公司）；过氧化氢（天津 市东方化工厂）。 １．２蛋白质分子的固定 采用磁控溅射的方法先后在柱面棱镜的底面制 备厚度为２ｎｍ的铬膜和厚度为５０ｎｍ的金膜，或者 采用湿化学方法直接在柱面棱镜的底面制备厚度为 ５０ ｎｍ的金膜［７］。由于金的化学性质稳定，无法通 过化学反应固定分子，所以将巯基烷醇自组装在金 膜表面，形成亲水性表面，再加入表氯醇形成环氧化 物共价固定葡聚糖，加入溴乙酸形成羧基共价固定 蛋白质分子（ａｎｔｉ—ＩｇＧ，羊抗人ＩｇＧ的抗抗体）。具 体的实验过程如下： 抗抗体分子的固定过程在常温下进行，将制备 有金膜的表面浸入５×１０ ｍｏｌ／Ｉ 巯基十一烷醇的 乙醇：水（体积比８０：２０）溶液中反应６ ｈ，可形成亲 水性表面。然后浸入０．６ ｍｏｌ／Ｉ 的表氯醇（溶剂为 ０．４ ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠和二甘醇二甲醚１：１的混合 液）溶液中反应４ ｈ。经过去离子水、乙醇、去离子 水彻底清洗后，在葡聚糖溶液（将３ ｇ葡聚糖溶于１０ ｍＬ的０．１ ｍｏｌ／Ｉ 氢氧化钠溶液中）中处理传感表 面２０ ｈ。浸入１ ｍｏｌ／Ｉ 溴乙酸（溶剂为２ ｍｏｌ／Ｌ的 氢氧化钠）中反应１６ ｈ形成羧甲基化的基体，用于 共价固定蛋白质分子；之后浸入新配制的ＥＤＣ和 ＮＨＳ １：１的混合溶液６ ｈ，来激活表面的羧基基团 （一ＣＯＯＨ）；然后浸入浓度为０．０２ ｍｇ／ｍＬ的ａｎｔｉ— ＩｇＧ溶液２ ｈ；最后用０．２ ｍｏｌ／Ｌ的乙醇胺盐酸缓冲 液来屏蔽没有反应的ＮＨＳ和羧基形成的中间体。 这样就完成了蛋白质分子探针（ａｎｔｉ—ＩｇＧ）在金膜表 面的固定。金膜表面分子膜结构如图１所示。 Ｉｌｌ ＩＩｌ ＩｌＩ ＩＩＩ ＩｌＩ Ｈ、Ｈ＿Ｎ Ｈ Ｈ／－Ｎ／Ｎ。Ｈ肽键 ＼ Ｉ ／ ／ 脓斑 １ 。Ｉ Ｉ Ｉ 葡聚锗等
ｌ Ｉ ｌ Ｉ Ｉ Ｉ ｌ １４ｓ Ｉ－ＩＳ ｂｉｇ １４ Ｉ－ＩＳ １４ ＨＳ 巯基
金
图１金膜表面分子膜结构示意图 实验中需要注意的问题有：实验使用的表氯醇、 溴乙酸和二甘醇二甲醚三种试剂都是有毒的物质， 操作时需要做好防护工作；固定葡聚糖后注意清洗 掉表面附着的粘稠的多余葡聚糖，否则这部分葡聚 糖就会溶解到随后加入的各种反应液中且与之反
