碱性成纤维生长因子对大鼠骨骼肌细胞缺氧复氧损伤的影响

解放军医学杂志２００２年ｉ０月第２７卷第１０期Ｍｅｄ　ｊ　Ｃｈｉｎ　Ｐ１　Ａ　Ｖｏｌ　２７　Ｎｏ　１０　Ｏｃｔ　２００２　

碱性成纤维生长因子对大鼠骨骼肌细胞缺氧复氧损伤的影响①　

１０００７１北京北京军医学院马　焰　高　伟　孙月芬周长满　・　８９５　・　

摘要应用培养的新生Ｗｉｓｔａｒ大鼠骨骼肌细胞缺氧复氧（Ａ／Ｒ）损伤模型，观察碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦ（　）对Ａ／Ｒ损伤及　损伤后骨骼肌细胞凋亡（ａｐ０ｐｔｏｓｉｓ）的影响．以探讨ｂＦＧＦ作为药物预处理保护骨骼肌细胞的可行性。结果表明，ｂＦＧＦ预处理呈浓度依赖　性地提高了Ａｆ／Ｒ后肌细胞存活率，减少了胞浆乳酸脱氢酶（Ｉ　ＤＨ）的漏出，明显上调了骨骼肌细胞凋亡相关基因蛋白Ｂｃｌ一２的表达，提示　ｂＦＧＦ对Ａ／Ｒ损伤的骨骼肌细胞有明显保护作用。　

关键词成纤维细胞生长因子，碱性：肌，骨骼：细胞缺氧复氧；基因．ｂｃｌ一２；预处理　中国图书资料分类号Ｒ７４６　

１　ＩＥ　Ｅ】　咖ｏＦ　ＢＦＧＦ　０Ｎ　ＡＮ０ⅪＡ　ＡＮＤ　ＲＥ１０ＸＹＧＥＮ　ｒ１０Ｎ　Ｄ　ＵＲＹ　ＯＦ　ＣＩ　ＪＩ　Ｉ］兀ＩＲＥＤ　Ｓ　ＬＥＬ　Ｉ　ＭＵＳ（　Ｅ　ａＥＵ　

Ｍａ　Ｙａｎ，Ｇａｏ　Ｗｅｉ，Ｓｕｎ　Ｙｕｅｆｅｎ　ｅｔ　ａ１．Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００７１　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）ｏｎ　ａｎｏ￣ａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ（Ａ／Ｒ）ｉ￣ｕｒｙ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｓｋｅｌｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔＯ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｕｓｉｎｇ　ｂＦＧＦ　ｆｏｒ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ．Ａｎ　Ａ／Ｒ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔｓ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｂＦ‘ＧＦ　Ｏｎ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｉｅａｋａｇｅ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙ—　ｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｂＦＧＦ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂｃｌ一２　ｉｎ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｔｍｕｎｏｈｉｓｔｏ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｂＦＧＦ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｈｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ，ｌｏｗｅｒｅｄ　ｔｈｅ　ｌｅａｋａｇｅ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　（ＬＤＨ），ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｕｐ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂｃｌ一２，ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｐｏｐｏｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｖｅｒｉｆｉｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ｂＦＧＦ　ｏｎ　Ａ／Ｒ　ｉｎｊｕｒｙ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｓｋｅｌｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ．　

Ｋｅｙ　ＷＯ［＇ｄｓ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ｂａｓｉｃ；ｍｕｓｃｌｅ，ｓｋｅｌｅｔａｌ；ｃｅｌｌ　ａｎｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；ｇｅｎｅｓ，ｂｃｌ一２；ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　

碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　

ｆａｃｔｏｒ＇ｂＦＧＦ）是广泛存在于骨骼肌细胞，并对骨骼肌生　

长发育具有重要生物效应的生长因子，在骨骼肌的生理　

病理过程中起重要作用　］。本研究应用培养的新生大鼠　

骨骼肌细胞缺氧复氧（ａｎｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ，Ａ／Ｒ）损伤　

模型，观察ｂＦＧＦ对Ａ／Ｒ损伤及损伤后骨骼肌细胞凋亡　

（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）的影响，以探讨ｂＦＧＦ作为药物预处理保护　

骨骼肌细胞的可行性。　

１材料与方法　

１．１细胞培养参照文献［２］方法进行。　１．２实验分组实验分为５组，Ｉ组为正常对照组；２组　

为Ａ／Ｒ组，给予等量磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）；３、４、５组为　

ｂＦＧＦ干预组，Ａ／Ｒ前分别在无血清培养液中加入不同　

浓度（１０、２０、４０ｎｇ／ｍ１）的ｂＦＧＦ（北京双鹭生物技术有限　

公司提供）。　

１．３缺氧复氧实验用无血清培基孵育１２ｈ后，将２、３、　

４、５组同时移至２　０００ｃｍｚ的恒温（３７℃）密闭容器内，连续　

充以无氧气体（９０　Ｎ　，１０　Ｃ０２），流速为２００ｍｌ／ｍｉｎ，６ｈ　

后取出，再置含９０　９／６空气，１０　９／６Ｃ（）２的培养箱内复氧１２ｈ。　

１组为正常对照组，培养板持续置于孵箱内培育。　

１．４细胞ＬＤＨ活性测定实验结束时，分别取每组培　养液测定漏出的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性（日立７１５０型全　

自动生化分析仪）。　

１．５细胞存活率每组取少量细胞悬液以０，４％０台盼　

蓝染色，统计拒染的活细胞数，计算细胞存活率。以上实　验重复４次，每次每组覆盖３孔。　

１．６　Ｂｃｌ一２免疫组化检测　取出长有细胞的盖玻片，细　

胞经４　多聚甲醛固定后，用抗Ｂｃｌ－２抗血清（北京中山　生物技术公司）１：２００稀释，按ＡＢＣ法进行免疫组化染　

色，用Ｎｉ—ＤＡＢ葡萄糖氧化酶系统显色，光镜下棕黄色为　

Ｂｃｌ一２阳性细胞。２００倍光镜下计数３０个相邻视野阳性　

细胞占总细胞数的百分比，用ＣＭＩＡＳ图像分析仪（北京　

航空航天大学研制）对Ｂｃｌ－２免疫反应阳性细胞作平均　

光密度色谱分析。　

１．７统计学处理实验结果以　±　表示，组问差异用ｔ　

检验进行统计学分析。　

２结果　

２．１　ｂＦＧＦ对肌细胞Ａ／Ｒ损伤后细胞存活率的影响　

与正常对照组相比，Ａ／Ｒ组细胞存活率明显降低（Ｐ＜　

ｏ．０１），用ｂＦＧＦ干预的各组细胞存活率均明显高于Ａ，　Ｒ　组（Ｐ＜０．Ｏ１），ｂＦＧＦ呈浓度依赖性地减轻了Ａ／Ｒ所造　

成的细胞损伤（附表）。　

２．２　ｂＦＧＦ对肌细胞Ａ／Ｒ损伤后ＬＤＨ漏出的影响　

ＬＤＨ为一种胞浆酶，当细胞受到损伤时，ＬＤＨ自细胞内　

漏出，其活性高低与细胞损伤程度呈正相关。Ａ／Ｒ组与　

正常对照组相比ＬＤＨ漏出明显增多（Ｐ＜０．Ｏ１），而ｂＦ—　

ＧＦ预处理减轻了Ａ／Ｒ造成的上述损伤，呈浓度依赖性　

马焰，医学硕士，教授。主要从事神经肌肉病、骨骼肌细胞凋亡方　面的研究。获军队科技进步三等奖４项。　①全军医学科研“九五”计划基金资助课题（编号９８Ｍ１１８）

　维普资讯 http://www.cqvip.com ・　８９６　・　

地减少了ＬＤＨ漏出（Ｐ＜０．０１，附表）。　解放军医学杂志２００２年１０月第２７卷第１ｏ期Ｍｅｄ　Ｊ　Ｃｈｉｎ　ＰＬＡ　ｌ　！　（ｊ！　

附表ｂＦＧＦ对肌细胞Ａ／Ｒ损伤的影响　±ｓ，ｎ一１２）　

注：与正常对照组相比，（１）Ｐ＜Ｏ．０１；与Ａ／Ｒ组相比，（２）Ｐ＜０．０１．（３）　Ｐ＜Ｏ．０５；与ｂＦＧＦ（１０ｒｉｇ）４－Ａ／Ｒ组相比，（４）Ｐ＜０．０１，（５）Ｐ＜０．０５；与ｂＦ—　ＧＦ（２０ｎｇ）＋Ａ／Ｒ组相比，（６）Ｐ￣Ｏ．０１，（７）Ｐ＜Ｏ．０５　

２．３　ｂＦＧＦ对肌细胞Ａ厂Ｒ损伤后Ｂｃｌ一２表达的影响　

正常对照组肌细胞Ｂｃｌ－２有一定表达（图１，封３），Ａ／Ｒ组　

肌细胞Ｂｃｌ一２表达很低（图２，封３）．而经ｂＦＧＦ孵育的肌　

细胞Ａ／Ｒ后Ｂｃｌ一２免疫反应增强（图３，封３），Ｂｃｌ－２阳性　

细胞数目及Ｂｃｌ－２阳性细胞平均光密度明显高于Ａ／Ｒ组　

（Ｐ＜０．０１）。　

２．３．１　ｂＦＧＦ对Ａ厂Ｒ后＆卜２阳性肌细胞平均光密度　

的影响１组的肌细胞平均光密度为０．１３±０．０５，２组的　肌细胞平均光密度为０．０８±０．２０（与１组比，Ｐ％０．０１）；　

３、４、５组肌细胞平均光密度分别为０．１５±０．０６（与２组　

比，Ｐ＜０．０１）、０．２０＿－４－０．１０（与３组比，Ｐ＜０．０１）和０．２５±　

０．０５（与４组比，Ｐ＜０．０５）。　

２．３．２　ｂＦＧＦ对　Ｒ后Ｂｃｌ－２阳性肌细胞百分比的影　

响　１组的肌细胞Ｂｃｌ－２阳性的百分比为（２３．３－＋－４．２）　，　

２组的肌细胞Ｂｃｌ－２阳性的百分比为（１４．３±３．３）　（与１　

组比，Ｐ＜０．０１）；３、４、５组的肌细胞Ｂｃｌ－２阳性的百分比　

分别为（２３．６±５．９）　（与２组比，Ｐ＜０．０１）、（３４．７±　５．８）　（与３组比，Ｐ＜０．０１）和（４０．８±４．２）　（与４组比，　

Ｐ＜０．０５）　Ｒ造成的肌细胞损伤有明显保护作用。　

Ｂｃｌ一２原癌基因蛋白是位于线粒体膜或核膜及溶酶　

体膜的膜蛋白，其作用为抑制多种原因引起的细胞凋亡。　

有关Ｂｃｌ－２基因家族在肌细胞中作用的研究，国外已有　

报道，认为Ｂｃｌ一２的高表达有助于维持肌细胞的存活，持　

续增加的Ｂｃｌ－２高表达可对抗Ｂａｘ促进凋亡的作用　］。　

本研究结果表明，正常对照组Ｂｃｌ－２的表达并不高，单纯　

Ａ／Ｒ组ｔＭ　２表达呈低水平，而ｂＦＧＦ预处理各组则呈　

现出浓度依赖性的Ｂｃｌ　２的高表达，与Ａ厂Ｒ组相比，各组　均有非常显著性意义（Ｐ＜０．０１）。与正常对照组相比，　

ｂＦＧＦ　２０ｎｇ＋Ａ／Ｒ组及ｂＦＧＦ　４０ｎｇ＋Ａ／Ｒ组差异有非常　

显著性意义（Ｐ＜０．０１），说明ｂＦＧＦ浓度大于２０ｎｇ／ｍｌ时　即有显著作用。单纯Ａｌ厂Ｒ组肌细胞Ｂｃｌ一２表达较正常对　

照组下调，表明骨骼肌细胞缺氧复氧受损后，除可引起　

肌细胞坏死外尚可诱导肌细胞凋亡ｌ　］，而ｂＦＧＦ可明显　

上调Ａ／Ｒ肌细胞Ｂｃｌ－２表达，抑制肌细胞凋亡。这与本　

实验得出的ｂＦＧＦ能提高Ａ厂Ｒ肌细胞的存活率，减少　

Ｉ　ＤＨ的漏出的结论相一致。　

ｂＦＧＦ对Ａ厂Ｒ细胞保护作用的机制，可能为ｂＦＧＦ　

与肌细胞膜上高亲和力ＦＧＦ受体（ＦＧＦＲ）结合形成二聚　

体激活物，激活了细胞内的酪氨酸蛋白激酶（ＰＫＣ），通过　ＰＫＣ介导的一系列复杂的生化过程影响多种基因转录，　

抑制凋亡基因的转录表达，诱导或激活凋亡抑制基因，如　Ｂｃｌ一２基因等的表达，从而抑制细胞凋亡＿Ｅｊ。　

本研究结果表明，缺氧复氧能使体外培养的骨骼肌　

细胞发生凋亡，ｂ　Ｆ可明显减轻骨骼肌细胞缺氧复氧　

后的损伤和凋亡，表现为提高了Ａ厂Ｒ后肌细胞存活率，　减少了ＬＤＨ胞浆酶的漏出及促进Ｂｃｌ　２基因蛋白的高　

表达，提示ｂＦＧＦ对骨骼肌Ａ／Ｒ损伤有一定保护作用。　

３讨论　

近期研究表明，骨骼肌细胞中不仅存在有ｂＦＧＦ特　

异性受体（ＦＧＦＲ），而且本身也合成和分泌ｂＦＧＦｃ　。　

缺血缺氧、创伤等因素常导致骨骼肌内源ｂＦＧＦ含量减　

少，而外源性ｂＦＧＦ有助于损伤组织的恢复　］。　

本研究应用外源性ｂＦＧＦ，观察ｂＦＧＦ对培养骨骼　

肌细胞Ａ厂Ｒ损伤的影响，实验结果表明，ｂＦＧＦ预处理　

呈浓度依赖性地减轻了骨骼肌细胞的Ａ／Ｒ损伤。