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原位杂交具体步骤

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原位杂交流程 以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针对石蜡切片进行mRNA检 测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有但没有一本书是专为这个目的而系 统地加以总结的因此特加以综合供同行参考在具体操作过程中很多地方可酌情变更。 在临床应用中常常可以买到已经标记好的商品探针那么前面一大部分扩增基因、 酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去从石蜡切片处理做起即可。 下面介绍的方法笔者已亲手做过数次可获满意结果。 主要操作步骤 制备感受态细菌 用含目的基因的质粒转化细菌 小量培养转化的细菌 小量提取质粒 小量酶切质粒 电泳鉴定 大量培养转化的细菌 大量提取质粒 大量酶切质粒 电泳分离、回收及纯化 标记探针 石蜡切片的处理 预杂交、杂交 杂交后处理 抗体连接、显色

制备感受态细菌 【试剂及配制】 1LB液体培养基 在900ml三蒸水中加入 胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(bacto-extract) 5g NaCl 10g 磁力搅拌使完全溶解用5mol NaOH调节pH至7.0如用进口试剂则不必调。定 容为1000ml高压灭菌20min。 20.1mol CaCl2溶液 1.1g无水氯化钙溶于90ml三蒸水中定容至100ml用0.22μm滤器过滤除菌置 于灭菌试剂瓶中4℃保存。 【材料】 大肠杆菌单菌落或冻存菌种也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。

【操作方法】 1从37℃培养1216h的平板中用无菌的接种环用前酒精灯烧红晾凉挑一单菌 落转入含有5ml LB培养基的无菌试管37℃振摇 200r/min过夜。次日取菌液1ml 加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶37℃振摇培养200300r/min约23h 将烧瓶取出立即置冰浴1015min 2以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心 管中 34℃离心5000g × 10min回收细菌 4弃去培养液将管倒置于滤纸上1min流尽培养液 5用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体置冰浴30min 64℃离心5000g × 10min弃上清倒置于滤纸上1min 7加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 重悬菌体动作要轻 8置4℃冰箱1224h即可用于转化。

感受态细菌的冻存 一次制备的感受态不能用完可冻存起来备用。将甘油装1.5ml EP 管中沸水浴 10min以杀菌。将感受态细菌分装成400μm一份每份加30%体积的甘油充分混匀 置-70℃冰箱一年内可使用。

用含目的基因的质粒转化细菌 【试剂及配制】 1LB液体培养基 2氨苄青霉素Amp选择性培养基 LB培养基中加入1.5%的琼脂15g/L高压灭菌20min取出在无菌条件下冷 却至50℃左右时烧手但尚可忍受加入抗生素或其他必需成分如为氨苄青霉素Amp 选择性培养基则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入即每ml培养 基加入1μl氨基苄。 3氨苄贮存液 将氨苄青霉素钠溶于三蒸水配成50mg/ml溶液以0.22μm滤纸过滤1ml一份 分装存于-20℃。

【操作方法】 1无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的 感受态细菌时将其从-70℃冰箱取出握于手中待其解冻后立即吸取200μl 转移至 10ml无菌玻璃试管中剩余的感受态弃去不能再冻存复用 2每管加质粒50100ng轻轻旋转以混合内容物在冰上放置30min 342℃ 水浴热休克90s不要摇动试管 4每管加无抗生素的LB培养基1ml37℃摇床温和摇振100150r/min45min 5用无菌的弯头玻璃铺菌器用前酒精灯烧再晾凉将200μl菌液铺于含氨苄青 霉素的琼脂平板表面37℃放置20min然后倒置培养1420h37℃。 小量培养转化的细菌 【操作方法】 1取灭菌处理的10ml 玻璃试管用无菌吸管加入约5ml LB液体培养基再加入 50mg/ml 氨苄青霉素5μl 2用接种环或无菌牙签挑取单菌落送入培养液中晃动使细菌进入培养液封好管口 337℃摇床100200r/min约612h可过夜使生长饱和。

质粒的少量提取 【试剂及配制】 1溶液Ⅰ 葡萄糖C6H12O6·H2O 1.982g 三蒸水 160ml 0.5mol EDTA pH8.0 4ml 1mol Tris-Cl pH8.0 5ml 以三蒸水定容至200ml高压灭菌4℃保存 0.5 mol EDTA pH8.0 的配制 Na2EDTA·H2O 186.1g 如无水则为175g 三蒸水 700ml 边磁力搅拌边加入固体NaOH缓慢少量加入待充分溶解pH接近8.0用酸度计 调节pH8.0 HCl/NaOH 1mol Tris-Cl pH8.0 的配制 Tris 碱 121g 三蒸水 800ml 充分搅拌用浓盐酸将pH调节至8.0酸度计测量 2溶液Ⅱ 配制50ml的量现用现配。 10 mol NaOH 1ml 三蒸水 40ml 10% SDS 5ml 用三蒸水定容至50ml 10mol NaOH 的配制 40g NaOH晶体加三蒸水至100ml 10% SDS 的配制 戴口罩称10g SDS溶于80ml三蒸水中68℃助溶加数滴1mol HCl调pH7.2 定容至100ml 1mol HCl 的配制 于通风橱中三蒸水91.4ml浓盐酸8.6ml混匀 3溶液Ⅲ 5mol 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 三蒸水 28.5ml 高压灭菌4℃保存 5mol 乙酸钾配制200ml 乙酸钾 98.14g 三蒸水 160ml 搅拌溶解定容至200ml; 43ml 乙酸钠NaAcpH5.2 配制500ml 乙酸钠CH3COONa·H2O 201.1g 三蒸水 200ml 用冰乙酸调节pH为5.2三蒸水定容至500ml高压灭菌4℃保存。 5平衡酚 在粗酚中加入0.1% 8-巯基喹啉然后倒入0.1mol Tris-Cl pH8.0避光磁力搅拌4h 静置后移去水相再加0.1mol Tris-Cl pH8.0搅拌、去除水相反复进行直到水相pH>7.8 时为止装棕色瓶4℃保存。 6TE 缓冲液 pH8.0 配制最终使10mmol Tris-Cl pH8.0 1mmol EDTA pH8.0 7其它试剂氯仿乙戊醇V/V=241、无水乙醇、70%乙醇

【操作方法】 1取1ml菌液置于1.5ml的EP管中10000g×30s 离心 2控尽上清液 3加溶液Ⅰ 100μl重悬菌体 4加溶液Ⅱ 200μl 倒转均匀 5加溶液Ⅲ 150μl 混匀 610000g×5min 离心 7转移上清至另一EP管 8加等体积平衡酚混匀室温离心8000g×5min 9小心吸取上清转移至另一EP管中勿将酚层吸出 10重复8、9的步骤 11等体积氯仿乙戊醇混匀 12离心8000g×5min 13转移上清至另一EP管 14加1/10体积3mol NaAc pH5.2 和2.5倍体积的无水乙醇混匀 15置液氮10min 或-20℃冰箱1h 16离心10000g×10min 17弃上清留沉淀70%乙醇洗一次 18离心10000g×10min 19弃上清留沉淀晾干 20加TE pH8.0 50μl 溶解沉淀 21加RNase A (10mg/ml) 35μl 混匀稍离心 2237℃ 水浴30 min 23-20℃ 保存待用。

小量酶切质粒 鉴定常用20μl反应体系。 【操作方法】 1在灭菌的新EP管中加入7μl三蒸水 2加入10×缓冲液2μl  3加限制酶5μl  4最后加入质粒DNA10μl  5稍离心混匀 637℃水浴11.5h 7无水乙醇沉淀2.5倍体积无水乙醇混匀液氮10min或-20℃ 30min离心 8弃上清晾干加10μl TE建立第二个酶切体系37℃ 11.5h

电泳鉴定 【试剂及配制】 10.5× TBE 先配5× TBE贮存液然后用三蒸水稀释10倍 5× TBE配制1000ml Tris 碱 54g 硼酸 27.5g 0.5mol EDTA pH8.0 2ml 2EB 10mg/ml 3琼脂糖 4上样缓冲液 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 30%甘油

【操作方法】 1用胶带纸封住洗净、晾干的电泳胶盒两端放好梳齿水平放置于工作台上 20.5× TBE + 琼脂糖 1%电炉上融化勿暴沸待其冷却至5060℃ 时加

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昆虫原位杂交

昆虫原位杂交

昆虫原位杂交一、昆虫原位杂交是什么呢？哎呀，小伙伴们，昆虫原位杂交可有趣啦！简单来说呢，就是一种在昆虫身体里直接做的杂交技术。

你想啊，昆虫那么小一只，要在它身体里搞这么复杂的事情，就像在一个小小的城堡里进行一场神秘的魔法实验一样。

这个技术啊，就像是给昆虫细胞里的基因们安排了一场相亲大会。

科学家们呢，要找到那些来自不同地方的基因“小帅哥”和“小美女”，然后让它们在昆虫细胞这个特殊的“相亲场地”里见面，看看能不能擦出爱的火花，组合成新的基因组合。

二、昆虫原位杂交的步骤有哪些呢？1. 准备工作首先得抓昆虫啦，不过这可不能乱抓哦。

要根据研究的目的，选择合适的昆虫种类。

比如说，如果是研究某种蝴蝶翅膀颜色的基因，那就得专门去找那种蝴蝶。

然后呢，要把昆虫处理一下，让它的细胞能够乖乖听话，就像要把调皮的小孩子哄好，才能让他们配合做游戏一样。

还得准备各种试剂呢。

这些试剂就像是做菜的调料，少了哪一种都不行。

像有一些可以让细胞的结构更清晰的试剂，还有能标记基因的特殊试剂。

2. 杂交过程要把昆虫的细胞或者组织小心翼翼地放在一个特制的环境里。

这个环境的温度、湿度什么的都得控制得很好，就像给小婴儿营造一个舒适的小床一样。

然后把那些带有标记的基因片段放进去，让它们去找自己的“另一半”。

这个过程有点像在大海里捞针，但是科学家们有自己的小窍门，能让这个过程更顺利。

在杂交的时候，还要时刻盯着，就像守着一个小火炉，火候不对就不行。

要保证基因们能够准确地结合，不能让它们乱搭伙。

3. 检测环节杂交完了之后，要看看有没有成功呀。

这时候就需要用到一些特殊的仪器了，这些仪器就像超级侦探一样，能够发现那些成功结合的基因组合。

如果没有检测到，那可能就得重新来一遍，就像做饭没做好，得重新下锅一样。

三、昆虫原位杂交有啥用呢？1. 研究昆虫的进化你知道吗？通过昆虫原位杂交，我们可以了解昆虫的基因是怎么变化的。

就像看一部昆虫家族的历史纪录片一样，能知道它们是怎么从古老的祖先慢慢变成现在各种各样的模样的。

原位分子杂交的基本过程

原位分子杂交的基本过程

原位分子杂交的基本过程原位分子杂交是一种用于研究基因表达模式和功能的重要技术。

它通过将互补的标记探针与待检测的目标序列进行杂交，然后通过探针的标记信号来确定目标序列在组织或细胞中的位置和表达水平。

下面将详细介绍原位分子杂交的基本过程。

第一部分：准备工作在进行原位分子杂交之前，需要进行一系列的准备工作。

首先，需要获取目标序列的核酸样本。

这可以通过提取组织或细胞中的总RNA或特定的mRNA来实现。

然后，需要制备互补的标记探针。

标记探针可以使用放射性同位素、荧光染料或酶标记等方法进行标记。

最后，需要准备组织切片或细胞扩展片，以便进行杂交反应。

第二部分：杂交反应杂交反应是原位分子杂交的核心步骤。

首先，将标记探针与待检测的目标序列进行杂交。

这一步可以通过将探针和目标序列共同溶解在杂交缓冲液中，然后在适当的温度下进行孵育来实现。

杂交的温度和时间会根据探针和目标序列的性质而有所不同。

通过杂交，标记探针将与目标序列形成稳定的双链结构。

第三部分：探针检测杂交完成后，需要对标记探针进行检测。

具体的检测方法会根据标记探针的性质而有所不同。

例如，如果使用的是放射性同位素标记探针，可以通过放射自显影或液体闪烁计数等方法进行检测。

如果使用的是荧光染料标记探针，可以通过荧光显微镜或流式细胞术等方法进行检测。

如果使用的是酶标记探针，可以通过酶的催化反应产生的显色反应进行检测。

第四部分：结果分析在完成探针检测后，需要对结果进行分析解读。

根据探针信号的强度和分布情况，可以确定目标序列在组织或细胞中的位置和表达水平。

例如，如果探针信号在细胞核中出现，可以推断目标序列参与了基因转录和表达过程。

如果探针信号在细胞质中出现，可以推断目标序列参与了蛋白质合成和运输过程。

通过对不同组织或细胞样本的比较分析，可以揭示目标序列的功能和调控机制。

第五部分：优势和应用原位分子杂交具有许多优势和应用价值。

首先，它可以在组织或细胞水平上直接观察目标序列的表达模式和功能，有助于深入理解基因调控网络和细胞信号传导通路。

原位杂交名词解释

原位杂交名词解释

原位杂交名词解释
原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用
于检测和定位特定的核酸序列在细胞或组织中的分布情况。

该技术利用一段含有探针的核酸序列与待检测样品中的相应核酸序列进行互补杂交，通过标记的探针的位置和数量来确定目标序列的位置。

原位杂交的操作一般分为以下几个步骤：
1.固定样本：首先需要将待检测的细胞或组织样本固定在载玻
片或载体上，使其不被破坏。

2.脱氧核酸的解性处理：将样本中的DNA或RNA进行解性处理，使其成为单链的状态，以利于与探针的杂交。

3.制备探针：设计和合成一段与目标核酸片段互补的核酸探针，并进行标记。

标记可以使用荧光标记剂、酶标记剂等。

4.杂交：将制备好的探针加到固定的样品上，在合适的温度和
离子平衡条件下，使探针与待检测的样品中的目标序列发生互补杂交。

5.洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除未与目标序列相互补的探针。

6.检测和成像：利用显微镜或其他成像设备观察和记录探针的
标记位置和数量，以确定目标序列在样品中的分布情况。

原位杂交技术可以用于很多领域，如遗传学、细胞生物学和病理学等。

它可以用来研究基因表达、染色体异常、病原体感染等问题，帮助科学家更好地了解细胞和组织的结构和功能。

此外，原位杂交还可以用来诊断疾病，如肿瘤、遗传病等，通过监测特定基因的表达情况，帮助医生做出正确的诊断和治疗方案。

总的来说，原位杂交是一种研究和定位目标核酸序列在细胞或组织中分布情况的技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，可以广泛应用于生命科学的各个领域。

荧光原位杂交技术原理及操作步骤

荧光原位杂交技术原理及操作步骤

荧光原位杂交技术原理及操作步骤1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。

20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。

1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。

20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。

1.原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。

它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。

将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素.地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性.定量或相对定位分析。

2.实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

3.特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。

用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。

缺点是探针不稳定.自显影时间长.放射线的散射使得空间分辨率不高.及同位素操作较繁琐等。

采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。

FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1.荧光试剂和探针经济.安全；2.探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3.实验周期短.能迅速得到结果.特异性好.定位准确；4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。