piggyBac转座子及其在转基因昆虫中的应用

科技前沿piggyBac转座子及其在转基因昆虫中的应用3

王建军133　王常春1　韩召军2(1.扬州大学园艺与植物保护学院　江苏扬州　225009;

2.南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室　江苏南京　210095)

AdvancesonpiggyBactransposonanditsapplicationsininsecttransgenesis.WANGJian2Jun133,WANGChang2Chun1,HANZhao2Jun2(1.CollegeofHorticultureandPlantProtection,YangzhouUniversity,Yangzhou　225009,China;2.KeyLaboratoryofMonitoringandManagementofPlantDiseasesandPests,MinistryofAgriculture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing　210095,China)Abstract　ThepiggyBacelementisaTTAA2insertionsitespecificDNAtransposonandwasoriginallydiscoveredinTrichoplusiani.ThepiggyBacelementiscapableofpreciseexcisionandshowshighfrequencyoftransformationininsectgenome,anditsactivityislessrestrictedbyhostfactors.ThesecharacteristicsmakepiggyBacthemostwidelyusedgenevectorininsecttransgenesis.RecentstudiesrevealedthatpiggyBac2likeelementisdistributedinawidevarietyofinsectandotherorganisms.Inthisreview,weintroducedthestructureandtranspositioncharacteristicsofpiggyBacanditsapplicationininsecttransgenesis,andthedistributionofpiggyBac2likeelementswasalsodescribed.

Keywords　piggyBac,transposon,insecttransgenesis,insectgenome,genevector

摘　要　piggyBac是一种从粉纹夜蛾Trichoplusiani.中分离到的、具有TTAA插入位点特异性的DNA转座子。piggyBac可在昆虫基因组中准确切离,转化频率较高,并且不受宿主因子的限制,是目前转基因昆虫研究中应用最广的转座子载体。近年来的研究发现,piggyBac类转座子广泛分布于昆虫和其他生物基因组中。文章从piggyBac的结构、转座特性、在转基因昆虫中的应用以及piggyBac类转座子的分布等几个方面综述了piggyBac的研究进展。关键词　piggyBac,转座子,转基因昆虫,昆虫基因组,基因载体

3国家自然科学基金项目(30671375,30871642)。33通讯作者,E2mail:drjianjun@yahoo.com.cn

收稿日期:2009206230,修回日期:2009209209

转座子或转座元件(transposableelement)是广泛分布于真核生物基因组中的一种可移动的DNA重复序列,是真核生物基因组的重要组成部分,也是宿主进化的重要动力之一。按照转座机制及序列特征,转座子可分为反转录转座子和DNA转座子两大类,前者编码反转录酶,以RNA为中介,通过“拷贝和粘贴”机制(copyandpaste)进行转座,引起稳定突变;后者编码转座酶,一般直接通过“剪切和粘贴”(cutandpaste)机制发生转座,引起不稳定突变。近年来,随着DNA转座子作为基因载体在动植物外源基因转化以及作为插入突变原和基因标签在动植物基因分离和基因功能研究中的应用[1～4],DNA转座子正逐渐成为研究热点,其中

又以对piggyBac转座子的研究尤其受到重视和关注,本文介绍近年来国内外有关piggyBac

转座子的研究进展。

1　piggyBac的结构1.1　基本结构piggyBac转座子最初是从侵染粉纹夜蛾TrichoplusianiTN2368细胞株系的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(autographacalifornicanuclear

・566・200946(5)昆虫知识　ChineseBulletinofEntomology

polyhedrosisvirus,简称AcNPV)内分离得到的,并命名为IFP2[5]。piggyBac转座子全长2472bp,含有1个RNA聚合酶Ⅱ启动子、1个聚腺苷酸信号和1个编码594个氨基酸转座酶

的可读编码框[6],末端是长13bp的反向末端

重复序列(invertedterminalrepeats,ITRs),两端不对称分布着19bp反向亚末端重复序列(invertedsub2terminalrepeats)(图1)。

图1　piggyBac转座子结构示意图(引自Handler

[7]

)

112　核定位信号(nuclearlocalizationsignal,NLS)同其他大多数DNA转座子一样,piggyBac转座子也是在转座酶的催化下通过“剪切和粘贴”机制发生转座。由于转座子的整合与切离发生在真核生物细胞核内,而piggyBac转座酶的预测分子质量为68kDa,因此,需要在核转运蛋白的介导下主动转运通过核孔复合体进入核内。Sarkar等通过PSORTII分析预测piggyBac转座酶双向核定位信号位于C端551～571位的氨基酸簇(5’2PVMKKRTYCTYCPSKIRRKAN23’)内[8]。随后,Keith等构建了一系列由截短型Π缺失型Π突变型piggyBac转座酶和加强型黄色荧光蛋白(EYFP)与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster金属硫蛋白组成的融合蛋白,并转染Drosophilaschneider2(S2)细胞表达,在硫酸铜的诱导下,通过共聚焦显微镜跟踪piggyBac转座酶的定位模式,结果表明piggyBac转座酶双向核定位信号位于C端501～571位氨基酸簇内,并且位于该簇上游的一些带负电荷氨基酸对于piggyBac转座酶的核定位也很重要[9]。113　DDEΠDDD基序包括piggyBac在内的DNA转座子的转座酶以及反转录转座子的整合酶的另一个重要的结构特征是含有作为催化中心活性位点的DDEΠDDD基序。Sarkar等通过序列比对和应用NCBIConservedDomainSearch程序分析,推测组成piggyBac转座酶DDEΠDDD基序的氨基酸是268、346和447位天冬氨酸[8]。最近,Keith等通过piggyBac定点突变和在S2细胞中的质粒切离分析对这3个天冬氨酸以及同样高度保守的450位天冬氨酸残基的重要性进行了研究,发现这4个天冬氨酸突变都能够显著降低piggyBac在细胞中的切离频率[10]。

2　piggyBac的转座211　靶位点大多数转座子在发生转座时都会在基因组中产生靶位点重复(targetsiteduplication,TSD)。Cary等对插入AcNPV基因组中的piggyBac的靶位点分析发现,piggyBac在宿主基因组中特异性插入TTAA靶位点,并形成靶位点重复[6]。Fraser等对piggyBac在草地贪夜蛾Spodoptera

frugiperdaIPLB2SF21AE细胞系中的质粒切离分析发现,piggyBac插入TTAA位点,并能在辅助质粒p3E112编码piggyBac转座酶的反式作用下发生精确切离[11]。随后,对piggyBac在棉红铃虫Pectinophoragossypiella[12]、黑腹果蝇、埃及伊蚊Aedesaegypti和粉纹夜蛾[13]、冈比亚按蚊Anophelesgambiae[14]以及其他昆虫[7,15]细胞和

胚胎的质粒切离和质粒间转座分析也表明piggyBac插入TTAA位点。由于特有的转座酶和TTAA靶位点重复序列,piggyBac被归入一个新的转座子家族———TTAA特异性转座子家族或piggyBac家族[16]。此外,Cary等和Grossman等对piggyBac多个插入位点进行分析时发现,piggyBac在AcNPV基因组和质粒间转座分析pGDV1靶质粒中的插入位点一致序列为YYTTTTTTΠAARTAAYAG(Y=嘧啶,R=嘌呤,Π=插入位点)[6,14],而Li等发现piggyBac转座子在黑腹果

蝇基因组和质粒间转座分析sacB靶质粒中的

・666・　昆虫知识　ChineseBulletinofEntomology200946(5

)插入位点一致序列为AΠTNAΠTTTAAAΠT[17]。但Li等对已报道的piggyBac在pGDV1靶质粒、AcNPV基因组和种系转化昆虫基因组中的插入位点的序列比对分析发现,除靶位点TTAA外,piggyBac插入位点没有序列一致性,但靶位点5′端前4～5个碱基多为T,3′端后5～6个碱基多为A,表明piggyBac通常在富含A+T的区域插入[18]。212　转座酶和顺式作用元件对转座的影响对mariner类转座子的研究发现,当转座酶产物过多时,转座率反而下降即过表达抑制(over2productioninhibition)[19]。Wu等对piggyBac转座子在哺乳动物细胞系中的转座活性进行研究时发现,当供体质粒的量和编码转座酶的辅助质粒的量的比例为2∶1时,转座活性最高,随着辅助质粒的量的增加,转座活性迅速下降,表明piggyBac也存在过表达抑制现象,但其机制尚不明确[20]。DNA转座子在发生转座时,一般都依赖其自身编码的转座酶结合在两端反向末端重复序列的识别位点上而形成突起复合物,并将转座子从原整合位点切除,插入新的靶位点。Elick等通过对野生型和末端突变型piggyBac在草地贪夜蛾IPLB2SF21AE细胞系中的质粒切离分析发现,3′反向末端重复中的GGG以及靶位点中的TTA对于piggyBac的质粒切离是必需的,单个G碱基缺失能够阻止质粒切离的发生[21]。对piggyBac在粉纹夜蛾胚胎中进行的质粒切离分析发现,3′反向亚末端重复序列的缺失同样能够阻止质粒切离的发生[17],表明反向亚末端重复序列内可能也包含piggyBac转座酶的结合识别位点。此外,质粒间转座分析还发现,根据反向末端重复序列、反向亚末端重复序列及两者之间的间隔序列构建的piggyBac微小载体同样能够发生高效转座[17]。但随后在piggyBac介导的黑腹果蝇种系转化试验中却发现,piggyBac5′36～101位碱基和3′2031～2409位碱基的内部序列同样是高效转化所必需的,表明这部分内部序列内可能也包含转座酶或者宿主辅助因子的结合位点[18]。3　piggyBac类转座子的分布311　种间分布广泛性尽管粉纹夜蛾piggyBac转座子早在20世纪80年代就已经分离并克隆,直到2000年才通过Southern杂交和以piggyBac特异性序列为引物的PCR扩增,首次在双翅目昆虫橘小实蝇Bactroceradorsalis中分离到与粉纹夜蛾piggyBac具有高度同源性(95%～98%)但无转座活性的piggyBac类转座子(piggyBac2likeelements,