嗜盐菌XZ515中类BR蛋白基因部分片段的序列研究

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简报 第45卷第2期2000年1月讲学电毂 3 Li X N.Du Z Wu J 0 et al Growth—inhibitory and differentiation-inducing activity of d[methy[formamide Ln cu ̄ured human mailgnant glioma cells NeurosuJgery,I997,40(6):】250 ̄【258 4 Hirao Epp[g J J.Analysis of the mechanism(s)of metapbase 1 a[rest in strain LT mouse oocyles:participation ol MOS Development I997,I24(24):5107 ̄,51l3 5 Murakami M S,Vande Woude G F Analysis of the eady embryonic cell cycles of Xenopus;regulation of cell cycte length by Xe—wee【andMos Devetopmem.】998 】25f2}237-248 6 Oh B,Hwang S Y’SoRer D.et al Spindlin,a m 0r maternal transcript expressed in tbe mouse during the transition from oocyte to embryo Development.】997 【24(2):493-503 7 Oh B.HampL A.Eppig l 1 et al sPlN.a substrate i1 the MAP kinase pathway in mouse oocyte Mol Reprod Dev.I998 50f2):240-249 8 Proud C G P70 S6 kinase:an enigma with variations T1BS.[996.21【8I一【85 (I999.04.】3收稿,19994)9 ̄13收修改稿) 

@嗜盐菌XZ515中类BR蛋白基因部分片段的 

J5J~f66 序列研究 q 7 37I 6 王晖詹树萱孙庆安徐德强 赵玮 黄伟达 李庆国 (复且大学生命科学学院.上海200433 联系人,Email:LIQNGUOK@online sh.on) 摘要在一十新嗜盐菌H.spXZ515中,编码自螺旋C至螺旋G的视黄醛蛋白基因片段己用PCR 方法进行了扩增并测定了此基因片段的枝苷酸序列翻译出的氨基酸排列次序与菌紫质蛋白(br) 和at-1,at" 2相应蛋白的相应片段进行了比较.结果说明 在br蛋白中,对于完成质子泵功能和视 黄醛结合为关键性的氪基酰残基均为保守的,在br蛋白中、M145可能对于棍黄醛异构化反应是重 要的残基. 关键词嗜盐菌 古紫质置白基因 PCR序列 XZ ,8尺蛋臼茎目 

在前文中…报道了自西藏扎北湖中分离的一株嗜盐菌,即古细菌H,s口.XZ515,含有视黄 醛类蛋白(文献中称之谓古紫质).此蛋白已经我们分离和纯化 】.进一步研究说明 】,这是一 种类菌紫质(b r)蛋白,具有光驱动的质子泵功能但其质子在膜上输运的动力学过程在某些方 面又区别于H,halobium中菌紫质(br)的质子泵,如在br中质子在膜外侧释放超前于质子在膜 内侧接收,而在XZ515中,质子在膜外侧释放则明显滞后于质子的接收,另外在XZ515中,在 暗适应的类br蛋白中,其全反和l3.顺的异构化视黄醛比明显地大于br中的同类比口】.如能将 这些功能特点与这些蛋白分子氨基酸排列次序关联起来,对于阐明质子泵机理是很有价值的, 为此,本文研究了XZ515类BR蛋白基因主要片段的一级结构. Otomo等人 在研究多株古细菌后发现,在古紫质中,对于具有质子泵功能的类br蛋白来 说,在自A至G的7个跨膜螺旋间,虽然在N端其氨基酸排列次序在各个株系问的变异比较 明显,但在螺旋C和螺旋G内,都具有保守的氨基酸残基,从而可被利用来设计寡核苷酸片断 作为引物,进行PCR反应,扩增自螺旋C至螺旋G的基因片段.由于扩增出的这一片段,在 全蛋白总共为248个氨基酸残基中,除了在N端自l~90位的残基和在C末端突出于膜外侧 221~248残基外,包含了该蛋白分子的主要结构,也包含了该蛋白分子的质子泵通道的结构 

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维普资讯 http://www.cqvip.com 讲学正囊 第45卷第2期2000年1月 简报 核心,所以研究这一片段的结构,对于阐明其质子泵功能特点是具有非常重要意义的 本文研究了XZS15的类BR蛋白基因中自螺旋C至螺旋G的核苷酸排列次序,并将由此 反映出的蛋白质中氨基酸排列次序与br和另外两株古细菌ar-1,al"一2151的相应蛋白作了比较 研究结果说明,在br质子通道中,对于完成质子泵功能和视黄醛结合最为关键的氨基酸残基 确是保守的;XZ515中自C至G螺旋的蛋白片段内,具有与br相同的亲水指数,说明了此蛋 白和br一样也具有7个跨膜的0[。螺旋,某些位点突变如MI45F(表示F取代M的位点突变)对 于视黄醛的异构化反应可能有一定关联关系m1. 

1材料与方法 各种限制性核酸内切酶T4 Ligase和TaqDNA polymerase购白Boeringher公司,引物的台 成在Applied Biosystems公司39 l型PCR-mate DNA 台成仪上完成,并以该公司提供的Oligonucleotide Purification Cartridge(oPc)柱纯化. 5l5菌株培养方法如前文所述…,XZ515总DNA 按Vogelsang等人 方法进行抽提,DNA测序按双脱 氧法测定,试剂用购白Amershan Life Science公司的 Sequence Ve ̄ion 2.0 DNA Sequence Kit. XZ515的PCR反应.按Otomo141方法设计引物, 

PCR反应条件为100 nL反应体系25个循环;变性: 94 ,lmin;退火:60 ,2min;延伸:72 ,3rain反 应产物在4.O%(质量体积比)NuSieve 3:1 Agarose gel 电泳分离后得到了长度约为400 bp左右的片段(图1), 符合实际BR基因c.G片段间的长度. 2结果与讨论 2.1蛋白质基因序列测定 

bD MARKER BR 51 5 1353 【078 872 603 310 

图1 XZ515和br在螺旋c至螺旋G间的 PCR产物的琼脂糖电泳图谱 在4 O%(质量体积比)Nus÷ 3:1琼脂糖上分离 

将PCR反应得到的片段连接人pSK质粒后进行测序,测序结果列于图2 测序结果再一次表明,从PCR反应得到的核苷酸片段正是该基因中编码蛋白自螺旋C至 螺旋G的部分基因.Otomo等人设计的引物能在XZS15菌株中成功应用于PCR反应说明了此 设计的引物可用于含有类br蛋白的嗜盐菌菌株,并在自螺旋C至螺旋G的氨基酸序列测定的 基础上,作为一种快速方法筛选具有新的一级结构的新菌株. 2.2 4种类BR蛋白基因序列比较 将图2的结果与br,ar.1,al"。2[51的相应C.G序列同列于图3中,以便相互比较. 在图3中,指出了对于4种蛋白来说都是保守的氨基酸残基,也指出了对于部分蛋白来说 是保守的氨基酸残基,仔细分析可发现,在这4种蛋白中XZ515与其他蛋白间的同源关系又 不相同.XZ515蛋白与al"一1,al"-2蛋白有很大的同源关系,其中与al"。2的同源关系最近,它们之 间相同的氨基酸排列达到了95%,这4种蛋白间相同氨基酸的排列关系列入表1中. 

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维普资讯 http://www.cqvip.com XZ5】5C0 BiC0 arjCo at2cG 55.64 84 96 95 49 55 64 57 39 55 64 84 96 57 89 84 96 95 49 55.64 84 96 

根据表1所示,就4种嗜盐菌C.G片段的同源性可推论其在进化上的相互关系.515蛋白 与bI蛋白仅有55.6%的同源性,但与ar类蛋白阃的同源性却远大于此值说明了此蛋白与au 类蛋白应属于同一组,而与Halobium所具有br类蛋白却分化得比较远I由此可预见,来自不同 组的质子泵蛋白的行为亦可能有一定差异. 2.3蛋白亲水指数的比较 对br,arl,ar2,XZ5 15同一片段序列按Kyte和Doolittle方法 进行亲水性比较,用此方法 

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维普资讯 http://www.cqvip.com 斟.:筝屯矗第45卷第2期2000年1,El 简报 1:BRCC 2:AR1CG 3:AR2CG 4:L51 5CG helix C 91 100 helix D I1 0 l 20 1 30 14 0 I PLLLLDLALLVDADQGTILALVGADGIMIGTGLVGALTKVYSYRI ̄AI PLLLLDLALLAKVDRVSIGTLVGVDA12,1IVTGLVGALSHTPL^RYnr町_F PLLLLDL^LLAKVDRVTIGTLICvD^LMIVTGLIGALSKTPL^RYT吼F PLLLLDL^LL^XVDRVSIGTLICVDALMIVTGLIGALSKTPLARYTWLF 

15 0 l6 0 170 l 80 l 90 4 J 

l:BRCG STA^MLYILYVLFFCFTSK^ESMRPEVASTFXVLRNVTVVL SAYPVvwL 2:ARlCG STIL ̄IWLYFLATSLR从AxERGPEVASTFHTLr^LVLVLWTAYPI I 3:AR2cG STI^FLFVLYYLLTSLRSAAAKRSEEVRSTFNTLTALVAVL”AYPI I 4:L5 l 5CG STIAFLFVLYYLLTSLRSAAAQRSEEVQSTFNTLTALVAVLVO'AYPILWl ●● … }………Ⅲ● 

heIi x G 200 21 0 220 I J 

l:BRCG IGSEGAGIVPLNIETLLFMvLDVSAKVGFGLIL 2:AR1CG IGTEC^GVVCLGIETLLFMvLDvTAKVGFGFIL 3:AR2CG VGTEC^GVVCLGIETLAFMvLDVTAKVGFGFVL 4:L 515CG VGTEG^GVVGLGVETLAFMVLDVTAKVGFGLIL ●+ +…●}…●●图3 br和ar-l,ar.2及XZ515中的类br蛋白自螺旋C至螺旋G的氨基酸排列比较