水体中诺如病毒富集技术的研究

中国卫生检验杂志２０１５年１０月第２５卷第２０期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂ　Ｔｅｃ，Ｏｃｔ．２０１５，Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．２０　・３４１９・　水体中诺如病毒富集技术的研究　冯微宏，肖勇　无锡市疾病预防控制中心，江苏无锡２１４０２３　

・论著・　

摘要：目的评估不同实验条件下ＮａｎｏＣｅｒａｍ—ＰＥＧ富集法对水中诺如病毒（ＮＶ）的富集效果，以获得较优的富集方　法。方法构建诺如病毒阳性标准质粒，以此为模板，应用荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法绘制病毒定量标准曲线；将含诺如　病毒粪便悬液加入纯净水中，在不同实验条件下经富集操作，富集液经荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法进行绝对定量并计算最　终回收率，从而确定最优富集方法。结果通过病毒定量标准曲线确定荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法对水中诺如病毒的检　测灵敏度为１００　ｃｏｐｙ／　ｌ。本实验通过正交设计方法考察了洗脱液ｐＨ值、洗脱速度和ＰＥＧ浓度３个因素对最终病毒回　收率的影响，最终确定在洗脱液流速为３００　ｍｌ／ｍｉｎ，洗脱液ｐＨ值为９．５，ＰＥＧ６０００浓度为１３％的条件下病毒回收率最　高，达到２６．５５％。结论证明ＮａｎｏＣｅｒａｍ—ＰＥＧ富集法具有较好的病毒回收率，加以发展将为水源性诺如病毒疫情的　溯源提供可靠的实验室依据。　关键词：病毒富集；诺如病毒；回收率；ＮａｎｏＣｅｒａｍ滤器　中图分类号：Ｒ１２３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—８６８５（２０１５）２０—３４１９—０４　

Ｓｔｕｄｙ　０ｎ　ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　０ｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ　ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ　ｆｌｒ０ｍ　ｗａｔｅｒ　ＦＥＮＧ　Ｗｅｉ—ｈｏｎｇ．ＸＩＡＯ　Ｙｏｎｇ　ｉ　Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｚ　ａｎｄ尸ｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，　ｉ，Ｊｉａｎｇｓｕ　２１４０２３，Ｃ　ｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｎｒｉｃｈ　ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｎｏＣｅｒａｒｎ—ＰＥＧ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ　ｆｒｏｍ　ｗａｔｅｒ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＳＯ　ａｓ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈ　４・Ｉ　Ｉ　ｈｎｕｍ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｐｏｓｉ．　ｔｉｖｅ　ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ＳｔａｌｌｌＩ＿…Ｉ‘。ｔｌｗｅ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｑｕａｎｔｉｔａ—　ｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ．Ｆｅｃａｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ　ｗａｓ　ｓｅｅｄｅｄ　ｔｏ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｗａｔｅｒ．Ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗａｔｅｒ　ｔｈｅｎ　ｕｎ．　ｄｅｒｗｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ＲＴ—　ＰＣＲ，ｔｈｅ　ｖｉｒａｌ　ｃｏｐｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　ｅｌｕｔｅ　ａｎｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｌｏｔｔｅｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ。Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｐ１ｏｔｔｅｄ　ｓｔａｎｄ．　ａｒｄ　ｃｕｒｖｅ，ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｆｏｒ　ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ　ｗａｓ　１００　ｃｏｐｙ／　ｌ＿Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｆａｃｔｏｒｓ（ｅｌｕｅｎｔ　ｐＨ，ｅｌｕｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ＰＥＧ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）ｏｎ　ｆｉｎａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ａｎｄ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ．ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｌｕｅｎｔ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｏｆ　３００　ｍｌ／ｍｉｎ．ｔｈｅ　ｅｌｕｅｎｔ　ｏｆ　ｐＨ　９．５　ａｎｄ　ＰＥＧ６０ｏ０　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ．　ｔｉｏｎ　ｏｆ　１３％ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（２６．５５％）．Ｃｏｎｃｌｕ　ｓｉｏｎ　ＮａｎｏＣｅｒａｍ—ＰＥＧ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｍａｎ．　ｉｆｅｓｔｓ　ａ　ｓｏｕｎｄ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｉｆ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．ｉｔ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　ａ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｒａｃｉｎｇ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｏｕｔｂｒｅａｋ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ－　ｂｏｒｎｅ　ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｖｉｒｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ；Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｒａｔｅ；ＮａｎｏＣｅｒａｍ　ｆｉｌｔｅｒ　

人类诺如病毒（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ，ＮＶ）是全世界范围内　非细菌性急性胃肠炎的主要病因。诺如病毒属于人　类杯状病毒科（ｈｕｍａｎ　ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ，ＨｕＣＶ）诺如病毒属　（ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ，ＮＶ），可分为５个基因型（Ｇ　Ｉ、ＧⅡ、ＧⅢ、　ＧⅣ和Ｇ　Ｖ），其中Ｇ　Ｉ、ＧⅡ和Ｇ　Ｖ主要感染人　类¨　Ｊ。大量的诺如病毒可以通过病毒感染者的粪　便排出，因此，以病毒污染的食物或水为中介的粪一　口传播构成了诺如病毒传播的主要途径。以往研究　已经证明了诺如病毒在环境水体中的普遍存在，如未　处理的污水、自来水、河水、海水等　。诺如病毒在　水中或食物中的载量通常都很低，但足以致病，１０个一　１００个病毒颗粒即可。。　。如此低的病毒含量超出了　荧光定量ＰＣＲ的检测限，因此，为检测水体中的病　毒，需首先对水体进行浓缩处理。以往水体病毒（包　括冠状病毒）的研究中多应用阳离子或者阴离子过滤　器浓缩水体，提高病毒浓度以便进行ＰＣＲ检测　】，　但是对于水中诺如病毒至今却缺少一种高效、可靠、　稳定的富集方法。本研究采用一种新型的阳离子滤　器ＮａｎｏＣｅｒａｍ对水中诺如病毒进行富集，采用荧光定　量ＲＴ—ＰＣＲ进行检测并考察富集方法的回收率，最　终决定最优的富集方法。　

１材料与方法　基金项目：２０１３无锡市科技发展资金资助课题（ＣＳＥ３１Ｎ１３０１）　１．１　标本粪便标本由本实验室保存（２０１２年无锡　作者简介：冯微宏（１９７５一），男，博士，助理研究员，主要从事分子　市某次疫情中病例的粪便标本），经过荧光定量ＲＴ一　生物学研究工作。ＰＣＲ检测及测序确认为Ⅱ型诺如病毒后，用ＰＢＳ制成　・３４２０・　中国卫生检验杂志２０１５年１０月第２５卷第２０期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂ　Ｔｅｃ，Ｏｃｔ．２０１５，ｖｏ１．２５，Ｎｏ．２０　１０％的悬液，然后用等体积的异戊烷／氯丁烷（７：３，　Ｖ：Ｖ）进行振荡混合，５　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心混合物。吸取　上清，过０．２２　ｍ滤膜，所得即为诺如病毒颗粒悬液，　分装成每管１　ｍｌ，储存于一８０℃备用。　１．２　引物根据Ｋａｇｅｙａｍａ的报道＿】　，本研究合成　了如下引物和探针，用于荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ检测诺　如病毒以及标准质粒的构建。引物和探针均由生工　生物工程（上海）股份有限公司合成（表１）。　表１荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ所用引物序列　引物　引物序列（５　一３　）　ＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧｒＩＴＡＧＧＴＧＧＡ　ＩｌＧＡＧ　ＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴｃ棚１ＣＡＣＡ　ＦＡＭ——ＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴ——ＢＨＱ—－１　１．３仪器与试剂　ＡＢＩ　７５００　Ｆａｓｔ型实时荧光ＰＣＲ　仪（美国ＡＢＩ公司）、ＨＥ１２０型水平式核酸电泳仪（上　海天能科技有限公司）、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　５４１７Ｒ高速冷冻离　心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ公司）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　Ｐｌｕｓ核酸蛋白测定仪（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ公司）、Ｇｅｌ　Ｄｏｃ　ＸＲ＋凝胶成像仪（美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）、ＷＴ６００—２Ｊ　型精密蠕动泵及硅胶软管（保定兰格恒流泵有限公　司）；ＮａｎｏＣｅｒａｍ滤器（批号：ＧＦＲ００３０Ｈ０５）、Ｑｕａｎｔｉ—　Ｔｅｃｔ　Ｐｒｏｂｅ　ＲＴ—ＰＣＲ　Ｋｉｔ荧光定量一步法定量试剂盒　（批号：２０１４４８９７）、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　Ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　ｋｉｔ（批号：　１３６８５２３５）、ｐＭＤ１８一Ｔ连接试剂盒（批号：ＬＫ７６４－　３Ｇ）、Ｍ—ＭＬＶ逆转录酶（批号：ＣＫ２９３１Ａ）、ＲＮａｓｅ　Ｉｎ—　ｈｉｂｉｔｏｒ（批号：ＣＣＢ１６０１Ａ）、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（批号：　ＣＫＡ４８２１Ｄ）、琼脂糖（批号：ＬＪ０６０５Ｂ１００８Ｊ）、ｄＮＴＰ（批　号：ＢＦ７３０１Ａ）、Ｒｎａｓｅ—ｆｒｅｅ水（批号：１２３０Ｓ０８）、随机　六聚体引物（批号：ＣＮ２１０１ＢＡ）、０．２２　ｍ滤器（批号：　ＣＪ９３０１ＢＡ）、ＵＮＩＱ一２００柱式质粒ＤＮＡ中量抽提试　剂盒（批号：ＡＬ０６７Ｈ０７）、聚乙二醇６０００（ＰＥＧ６０００）、　牛肉浸膏（批号：ＨＤ８７４２Ｂ）、ＡｘｙＰｒｅｐ　９６　ＰＣＲ清洁试　剂盒（批号：ＫＢ１０１１０４７０一Ｇ）、ＴＧ１感受态细菌（批　号：ＧＳ７６１８３）。　１．４　方法　１．４．１　ＲＮＡ提取按Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　Ｖｉｒａｌ　ＲＮＡ　ｋｉｔ试剂　盒说明书提取。　１．４．２荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ检测采用ＡＢＩ　７５００实　时荧光ＰＣＲ仪进行ＰＣＲ检测，反应体系为：２×　Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ　ｐｒｏｂｅ　ＲＴ—ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　１２．５　ｔｘ１．ＧⅡ一　ＲｅａｌＦ（１０￣ｍｏｌ／Ｌ）０．５　ｌ，ＧＩＩ—ＲｅａｌＲ（１０　ｐ，ｍｏｌ／Ｌ）　０．５　ｕｌ，ＮｏｒｏＰｒｏｂｅ（１０　ｔｘｍｏｌ／Ｌ）０．１２５　Ｉｘｌ，Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｈ　ＲＴ　Ｍｉｘ　０．２５　Ｉｘｌ，Ｒｎａｓｅ—ｆｒｅｅ　Ｈ７０　９　Ｖ．１和模板ＲＮＡ　２　Ｉｘｌ。反应参数如下：５０　ｏＣ　３０　ｒａｉｎ；９５　ｑＣ　１５　ｍｉｎ，９４℃　１５　Ｓ，６０℃６０　Ｓ，共４Ｏ个循环，６０　ｃＩ＝收集荧光信号。　１．４．３　标准质粒的构建　以提取的病毒ＲＮＡ为模　板，通过逆转录ＰＣＲ和半巢氏ＰＣＲ扩增获得质粒插　入片段¨　，产物由ＡｘｙＰｒｅｐ　９６　ＰＣＲ清洁试剂盒进行　纯化回收，使用ｐＭＤ１８一Ｔ连接试剂盒连接ＰＣＲ回收　片段至Ｔ载体，连接产物转化大肠杆菌后生工生物工　程（上海）股份有限公司测序。　１．４．４质粒提取及拷贝数定量采用ＵＮＩＱ一２００柱　式质粒ＤＮＡ中量抽提试剂盒抽提转化菌中的质粒。　核酸蛋白测定仪测定质粒浓度，并根据质粒分子量及　阿佛伽德罗常数（　）换算成拷贝数。计算公式如下　Ａ＝Ｃ×　／Ｂ＋１４，Ａ为拷贝数（ｃｏｐｙ／ｔｘ１），Ｃ为标准　质粒浓度（ｎｇ／　１），Ｂ为标准质粒分子量（ｋＤ）。　１．４．５标准曲线的绘制及粪便原样标本中病毒拷贝　数定量将标准质粒首先稀释到１０ｍ　ｃｏｐｙ／　ｌ作为标　准曲线的最高浓度，再进行ｌＯ倍比稀释，直至浓度达　到１０　ｃｏｐｙ／　。按前述荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ条件进行　荧光检测。实验重复５次，取荧光扩增曲线ｃｔ值平　均值和对应拷贝数的１０底对数绘制标准曲线。同时　荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ检测保存的诺如病毒悬液，并根　据标准曲线算出所含诺如病毒的拷贝数。　１．４．６模拟水样应用ＮａｎｏＣｅｒａｍ滤器、ＰＥＧ进行富　集为避免环境水样成分的复杂性对实验方法的探　究产生干扰，本实验采用模拟水样进行实验操作。将　１　ｍｌ病毒悬液加入２　Ｌ纯净水中混匀即为模拟水样，　采用ＮａｎｏＣｅｒａｍ滤器进行２次浓缩，二次过滤完成后　滤腔内加入不同ｐＨ值的２５０　ｍｌ内含０．１　ｍｏｌ／Ｌ甘氨　酸的３％牛肉浸膏洗脱液。滤膜在洗脱液中浸泡　１５　ｒａｉｎ后，倒出洗脱液。将洗脱液ｐＨ值调至７．０，再　将洗脱液进行次级浓缩。次级浓缩采用ＰＥＧ浓缩　法，直接将ＰＥＧ６０００和ＮａＣ１固体加入洗脱液，配置成