水稻成熟胚愈伤组织的诱导与增殖研究

农 村 经 济 与 科 技 ２ ０ １ ７ 年 第 ２ ８ 卷 第 ２ ２ 期（ 总 第 ４ ２ ６ 期）
农艺 ・ 园艺
从水稻愈伤组织到小苗再生——植（ 西安 交通 大学思源中学 ，陕西 西安
７ １ ０ ０ ３ ８ ）
［ 摘 要 ］ 本 文以水稻 成熟种子为材料 ，成功诱 导愈 伤组织形成并对愈伤 组织诱导分化 ，获得 了再 生的水稻幼苗 。该 实验过程进一步加深 了人 们对于植 物细胞全能性 的理 解。 ［ 关键词 ］水稻 ；愈 伤组织 ；植物细胞 全能性 ；再分化 ［ 中图分类号 ］￥ ５ １ １ ［ 文献标识码 ］Ａ
稻种子放到装有 Ｎ ６固体 培养 基的平皿 中，封 口后放于 ２ ８ ℃暗培 养箱中 ，培养 ４ － ５周。 １ ． ４ ． １ ． ５挑取水稻胚周围长出的亮 黄色且致密 的颗粒状愈伤组 织 ，转移到新的 Ｎ ６固体培养基上 ，相同条件继续培养两周左右。 １ 材 料 和 方 法 １ ． ４ ． ２愈伤组织 的分化和小苗 的生根培养 １ ． １ 植物材料 １ ． ４ ． １ ． １将亮黄色致密的抗性愈伤组织放 到分化培养基上 ，在 水稻材料为野生型品种 “ Ｈ￣ ｉ ａ ｎ ｇ ｌ ９ ” ２ ８ ℃光照培养箱 中， １ ６ ｈ光照 ／ ８ ｈ 黑暗诱导分化。培养 １ 周左 右时 ， １ ＿ ２ 培 养 基 可以看到愈伤 组织长 出绿色 芽点 ，继续培养 ３周左右 ，会 分化出 １ ． ２ ． １ 水稻愈伤组织诱导和继代培养基 （ Ｎ ６） ： Ｎ ６ 基本培养基 幼苗 。 ３ ． ９ ９ ｇ ／ Ｌ ，脯氨酸 ２ ． ８ ７ ８ ｇ ， Ｌ ，水解酪蛋 白 ０ ． ３ ｇ ／ Ｌ， ２ ，４ 一 Ｄ ２ｍ ｇ ／ Ｌ， １ ． ４ ． １ ． ２ 待幼苗长至 ５ ｃ ｍ左右时 ，转到生根培养基中，相同条 蔗糖 ３ ０ Ｌ，植物凝胶 ４ Ｌ ，用 Ｋ Ｏ Ｈ调 ｐ Ｈ至 ５ ． ８ 。 件下继续培养两周 ，至幼苗长 出健壮发达 的根系。 １ ． ２ ． ２分化培养基 ： １Ｓ基本培养基 ４ ． ４ ｇ ／ Ｌ ，酸水解酪蛋 白 ０ ． ８ ｇ ／ Ｌ ，蔗糖 ３ ０ ｇ 几，琼脂 粉 ６ ． ５ ｇ ／ Ｌ ，用 Ｋ Ｏ Ｈ调 ｐ Ｈ至 ５ ． ８ 。灭菌后 ２ 实验结果 加入 细胞 分裂素 （ ６ － Ｂ Ａ） ２ ｍ ｇ ／ Ｌ ，激动 素 （ Ｋ Ｔ） ２ ｍ ｇ ／ Ｌ ，吲哚乙 愈伤组织 原指植物体局部受伤后 ，在伤 口表面生成的新生组 酸 （ Ｉ Ａ Ａ） ０ ． ２ ｍｇ ／ Ｌ ，萘乙酸 （ Ｎ Ａ Ａ） ０ ． ２ ｍｇ ／ Ｌ 。 织 ，由薄壁细胞组成。在植物组织培养过程中 ，愈伤组织 的发生 １ ． ２ ． ３生根培养基 ： Ｍｓ 基本培养基 ２ ． ２ ｇ ／ Ｌ ，酸水解酪蛋 白 ０ ． ８ 过程包括 ： 外植体 中的活细胞经过诱导 ，恢复其潜在的细胞全能 Ｌ ，蔗糖 ３ ０ ｇ ， Ｌ ，琼脂粉 ５ ｇ ／ Ｌ ，用 Ｋ Ｏ Ｈ调 ｐ Ｈ至 ５ ． ８ 。 性 ，转变为分生细胞 ，即脱分化 ； 分生细胞 大量 增殖并且分化 为 以上 培养 基需 １ １ ５ ℃高 温高 压灭 菌 １ ５ ｍ ｉ ｎ ，灭 菌后 冷却 至 薄壁组织进 而形成愈伤组织 。 ５ ０ — ６ ０ ％在超 净工作 台加入 已经过滤除菌 的植物激 素 ，混 匀后分 脱分化过程 因植物种类 、外植体来源不同而有很大差 别 ，烟 装 到已灭菌 的培养皿 、育苗盒和生根试 管中用 于水稻愈伤组织 的 草和胡萝 ｂ 等植物 的脱分化较为容易 ，而禾本科 植物的脱分化较 诱导 、继代培养 、分化成苗和生根培养 。 难 ； 幼嫩组织的脱分化较成熟的组织脱分化容易。虽 然有研究表 １ ． ３ 激素母液的配制 明选用水稻幼胚 、花粉粒或者幼穗 可以获得更好的结果 ，但在科 １ ． ３ ． １ １ ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ ２ ，４ 一二氯 苯氧 乙酸 （ ２ ，４ 一 Ｄ）母 液 ，： 称 取 研 中还是常常使用成熟胚作为外植体诱导愈伤组织 ，主要原 因在 １ ０ｍ ｇ ２ ，４ 一 Ｄ粉末 ，用 １ ０ ｍＬ无水 乙醇溶解 ，分装后保存 于 ４ ￣ Ｃ 。 于水稻成熟胚便于贮存 ，取材方便 ，实验开展不受季节的限制 。 １ ． ３ ． ２ ２ ｍ ｇ ／ ｍ Ｌ激动 素 （ Ｋ Ｔ）母液 ： 称取 ２ ０ ｍｇ Ｋ Ｔ粉末 ，先 外源植物生长激素常用于诱导细胞脱分化 ，恢 复细胞 的全能 用少量 １ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｈ Ｃ １ 溶解 ，再加入蒸馏水定容至 １ ０ ｍＬ ，过滤除菌 性 ，常用 的生长激素有萘 乙酸 、吲哚乙酸 、２ ，４ 一 Ｄ等。经过研究 后分装 ，保存于 ４ ｏ Ｃ。 ’ 人员长期 的摸 索 ，水 稻成熟胚常用 ２ ，４ － Ｄ作为组织 培养添加 的 １ ． ３ ． ３ ２ ｍ ｇ ／ ｍＬ 一苄氨基腺嘌呤（ ６ － Ｂ Ａ） 母液 ： 称取 ２ ０ ｍ ｇ ６ － Ｂ Ａ 激素诱导愈伤 组织形成 。在本实验 中 ，我们使用 Ｎ ６培养基作为 粉末 ，先用少量 Ｉ ｍ ｏ ｆ Ｌ Ｈ Ｃ １ 溶解 ，再加入蒸馏 水定容 至 １ ０ ｍ Ｌ， 基础培养基 ， 在此基础上添加 ２ ． ８ ７ ８ ｇ ／ Ｌ 脯氨酸、 ０ ． ３ ｇ ， Ｌ 水解酪蛋白、 过滤除菌后分装 ，保存于 ４ ￣ Ｃ。 ２ ｍｇ ／ Ｌ ２ ，４ 一 Ｄ和 ３ ０ ｇ ／ Ｌ蔗糖 ，诱导水稻成熟胚脱分化产生愈伤组 １ ． ３ ． ４ １ ｍｇ ／ ｍ Ｌ吲哚 一 ３ 一 乙酸（ Ｉ Ａ Ａ坶 液 ： 称取 １ ０ ｍｇ Ｉ Ａ Ａ粉末 ， 织 ，得 到较好 的实验 结果 ，如 图 １ 所示 。成熟水稻种子脱去外颍 先 用少量无水 乙醇溶解 ，再加人蒸馏水定容 至 １ ０ ｍ Ｌ，过滤 除菌 后 ， 经过灭菌 ， 接种在诱导愈伤组织培养基上 ， 经过 １ ０天暗培养 ， 后分装 ，保存于 ４ ￣ Ｃ。 在种胚附 近有 少量愈伤组织形 成 ，如图 １ Ｃ中箭 头所示 。继续暗 １ ． ３ ． ５ １ ｍ ｇ ／ ｍＬ萘 乙酸 （ Ｎ Ａ Ａ）母液 ： 称取 １ ０ｍ ｇＮ Ａ Ａ粉末 ， 培养 ３ ０ — ４ ０天 ，愈伤组织经过增殖 ，在培养基上可 以看到淡 黄色 、 先 用少 量无水 乙醇溶解 ，再加入蒸馏水定容 至 １ ０ ｍ Ｌ ，过滤 除菌 松 散的生长状态 良好 的愈伤组织块 。此时的愈伤组织可以直 接作 后分装 ，保存于 ４ ℃。 为水稻遗传转化 的实验材料 ，也可继代保存 以备用 。 １ ． ４ 实验 方 法 【 参考文献 】 １ ． ４ ． １ 水稻胚性愈伤组织 的诱导和继代培养 … １ 张献龙 ． 植 物生物技 术 『 Ｍ］ ． 北京 ： 科 学出版社 ，２ ０ １ ２ ． １ ． ４ ． １ ． １ 选 取 成 熟 饱 满 的野 生 型水 稻 “ Ｈ￣ ｉ ａ ｎ ｇ ｌ ９ ” 的种 子 ，小 ｆ ２ 】张 东旭 ，周 增产 ， 卜 云龙 等 ． 植 物组 织培 养技术 应用研 究进 心剥去颖壳 ，然后装入 ５ Ｏ ｍ ｌ 离心管 中。在超净工作 台内 ，用无 展 卟 北 方 园艺 ，２ ０ １ １（ ０ ６）．

几种影响籼稻成熟胚愈伤组织诱导及再生的因素
刘元风;刘彦卓;贺红;王金花;李玲;李晓方
【期刊名称】《植物生理学通讯》
【年(卷),期】2004(40)3
【摘要】建立了适合5个籼稻品种成熟胚籼稻遗传转化的高效植株再生体系。

N6基本培养基有利于籼稻愈伤组织的诱导和继代培养 ;N6大量元素和MS微量元素有利于愈伤组织的分化。

降低分化培养基中蔗糖含量,加入适量山梨醇、Cu2+、Ag+和玉米素(ZT)均可明显提高水稻愈伤组织的再生植株频率,5个品种分化频率均达到75%以上。

【总页数】4页(P319-322)
【关键词】籼稻;成熟胚;愈伤组织;再生植株;品种;分化
【作者】刘元风;刘彦卓;贺红;王金花;李玲;李晓方
【作者单位】广东省农业科学院水稻研究所;华南师范大学生命科学学院,广州510631;莱阳农学院农学系;华南师范大学生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】S511.210.1
【相关文献】
1.2,4-D和6-BA对籼稻成熟胚愈伤组织诱导和植株再生的影响 [J], 苗春波;万志刚;孙丙耀
2.2,4-D和6-BA对籼稻成熟胚愈伤组织诱导和植株再生的影响 [J], 苗春波;万志
刚;孙丙耀
3.小麦成熟胚愈伤组织诱导及再生影响因素初探 [J], 周子凡;杨淑慎;郭欧燕
4.影响籼稻成熟胚愈伤组织植株再生频率的几个因素 [J], 高三基;陈如凯;马宏敏
5.几种影响矮种椰子成熟胚愈伤组织诱导的因素研究 [J], 李志瑛;穆治华;肖勇;范海阔
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组培常见英汉对照abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar （琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的) auxin（生长素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellular totipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosome doubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration （败育）dedifferentiation （脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid （二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate （除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植体）filter paper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）global embryo （球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone （激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）in vitro（体外）in vivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）male sterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristem culture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nod culture （茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture （花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplast fusion（原生质体融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不亲和）shoot tip（茎尖）sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（体细胞胚）somatic hybridization（体细胞杂交）somatic hybrid（体细胞杂种）stem（茎）stem tip culture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）sterile distilled water（蒸馏水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (继代) sucrose（蔗糖）terminal bud（顶芽）transfer （转移）virus eradication（脱毒）常用缩略语ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液）DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸）KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇）LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）一、请教关于水稻愈伤组织的问题:我的水稻愈伤组织经过转化后，基本上不分化，听说TDZ能帮助分化，请问是用TDZ完全代替KT，还是按一定比例加入？还有就是在分化过程中还需要再加入潮霉素和羧苄吗？我用的水稻品系是台北309，以前的分化培养基为MS+0.5/l谷氨酰胺+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+2mg/l KT+0.5mg/l 6BA+0.2mg/l NAA+300MG/L羧苄+50MG/L潮霉素。

摘要水稻成熟种子具有细胞全能性。

本实验以错误!未找到引用源。

+2,4-D为基本培养基，添加NAA和6-BA为分化培养基，对水稻种子材料进行体外培养，诱导形成愈伤组织，并进行分化。

在培养基中添加一定量的激素给种子形成愈伤组织提供动力。

结果表明，在合适的培养条件下愈伤组织的分化程度很高，但培养基因素或光照条件使得褐化现象严重。

关键词水稻成熟种子组织培养愈伤组织诱导分化激素1前言细胞工程是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。

其常用技术手段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。

根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程两大类。

本实验主要综述细胞工程中植物细胞工程的植物组织培养这一技术手段。

植物组织培养技术的应用范围包括快速繁殖、培育无病毒植物，通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。

植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织在分化形成植物体。

在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性，即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。

因而，每一个植物细胞可以像胚胎细胞一样，经离体培养再生成为植株。

随着细胞工程技术的不断发展，植物细胞和组织培养这一细胞工程技术也无例外地得到发展，目前已在许多植物上，特别是在农林生产实践中得到了广泛应用。

尤其在林木优良品种和无性系的快速繁殖方面进展较快。

本实验旨在利用NAA和6-BA的组合调控来诱导水稻成熟种子的愈伤组织，加深对外植体消毒、接种的无菌操作技术，学习外植体愈伤组织诱导的方法。