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博迈德质粒小量提取(磁珠法)

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质粒小量提取试剂盒(磁珠法)
目录号：PL02

试剂盒组成 保存
PL0202 100次 PL0203
200次

RNaseA（10mg/ml） -20℃ 300µl 300µl×2
溶液P1 4℃ 30ml 30ml×2
溶液P2 室温 30ml 30ml×2
溶液P3 室温 40ml 40ml×2

漂洗液WB 室温
25ml 25ml×2
第一次使用前按说明加指定量乙醇

洗脱缓冲液EB 室温 15ml 10ml×2
磁珠悬浮液 室温 1.5ml 1.5ml×2

保存条件：本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
储存事项:
1. 第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml）
置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA
残留，在溶液P1中补加RNase A即可。

2. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分
钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化。
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产品介绍：
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，磁珠在高盐、低pH值状态下选择性
地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高
pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从磁珠上洗脱。

产品特点：
1. 磁珠吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的
质粒产量高、纯度好， 可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种
分子生物学实验。

自备仪器及试剂：1，小型离心机，2磁力架(博迈德)，3无水乙醇
注意事项
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，
如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2. 溶液P3中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

3. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议
接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基， 过夜培养14-16个小时，可提
取出多达20µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应
适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用
量，其它步骤相同。

4. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD
260

值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条
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DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培
养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺
旋可以超过90%。

5. 质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知
道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其
确切大小。

6. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗
脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－
20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM
EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

操作步骤：
提示：
 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及
时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

 将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。
 将溶液P3放在冰上预冷，可以提高产量。
1. 取1.5-4.5 ml过夜培养的菌液，9,000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清，收集菌
体。

2. 用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。
3. 加250μl的溶液P2，温和地上下翻转4 -7次使菌体充分裂解。
4. 加350μl溶液P3，立即温和地上下翻转4 -7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，
13,000rpm离心5分钟，小心取上清。

5. 将上一步所得上清加入新的1.5ml离心管， 再加入15ul的磁珠悬浮液，震荡混
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匀，放置5分钟，（如需高产量，可放置10分钟）期间混匀几次。
6. 把离心管放到磁力架上，静置30sec，磁珠自动被吸附在管壁，吸弃上清，磁珠
分离要在磁力架上完成。

7. 加入500μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），颠倒混匀，放到磁力
架上，静置30秒，吸弃上清，磁珠分离要在磁力架上完成。

8. 重复7一次。
9. 吸净液体，室温放置5分钟，确保乙醇挥发干净，加50μl洗脱缓冲液EB，轻轻
吹打使磁珠完全悬浮于洗脱后，室温静置1分钟。

10. 把离心管放到磁力架上，静置30sec，磁珠自动被吸附在管壁，将洗脱液转移到
洁净的离心管中，-20℃保存备用。

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分子生物学实验技术实验操作指南

分子生物学实验技术实验操作指南

《分子生物学实验技术实验操作指南》目录1 植物基因序列分析 (3)2 引物设计的原则 (4)3 试剂的配置和灭菌 (5)4 植物基因组DNA的提取 (6)5 DNA的定量 (8)6 DNA的电泳 (9)8 PCR产物的回收 (12)9 PCR产物连接T载体和感受态细胞的转化 (14)10 菌落（液）PCR (17)11 质粒DNA的提取 (19)12 质粒DNA的酶切 (21)1 植物基因序列分析1.基因组DNA（genomic DNA, gDNA）：功能基因包括三个基本序列：5’上游区，转录区和3’下游区。

2.5’上游区和3’下游区：转录起始位点上游和转录终止位点下游的序列，主要起到基因表达调控作用。

3.转录区：转录起始位点和转录终止位点之间的序列，经核不均一RNA最终被加工为成熟的mRNA。

4.信使RNA（messenger RNA, mRNA）：由DNA的一条链作为模板转录而来的，携带遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。

由编码区、上游的5’非编码区和下游3’非编码区组成，5’端带有7-甲基鸟苷-三磷酸帽子结构，3’端有多腺苷酸尾巴。

5.互补DNA（complementary DNA, cDNA）：具有与某mRNA链呈互补的碱基序列的单链DNA。

6.蛋白质编码区（sequence coding for amino acids in protein, CDS）：与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列。

只有外显子，不含内含子。

7.5’非翻译区（5’-untranslated region, 5’UTR）：mRNA位于基因转录起始位点至编码区翻译起始密码子之间顺序。

8.3’非翻译区（3’-untranslated region, 3’UTR）：mRNA位于编码区翻译终止密码子下游一段不被翻译的序列。

2 引物设计的原则1.引物长度：一般为20-25bp。

若产物长度等于或小于500bp，可选用16-18bp的引物；若产物长达5kb，则需要用更长的引物。

质粒DNA的提取

质粒DNA的提取

质粒DNA的提取方案一常规小量提取(碱裂解法)【实验目的】(1)掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理及操作过程。

(2)掌握微量加样器的使用方法。

【实验原理】在NaOH存在的碱性环境(pH值12.0～12.6)中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA由于分子量小且缠绕紧密，仍为自然状态。

将pH值调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复可溶状态的。

通过离心，去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质等物质，上清液中的质粒DNA可用酚/氯仿抽提。

【实验试剂】(1)溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH值8.0)10mmol/LEDTA(pH值8.0)溶液I可成比配制，每瓶约100ml,在6.9×10°Pa(10lbf/in²)高压下蒸汽灭菌15min,贮存于4℃下。

(2)溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)1%SDS(3)溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml(4)酚(pH值7.8～8.0)。

(5)氯仿。

(6)TE缓冲液。

(7)6×DNA上样缓冲液。

(8)0.8%琼脂糖。

(9)无水乙醇。

【实验器材】(1)低温高速离心机。

(2)旋涡振荡器。

(3)Eppendorf管(EP管)。

(4)微量移液器。

(5)移液器头。

(6)电泳仪与电泳槽。

(7)紫外透射仪。

【实验样本】细菌(含某种质粒)。

【实验步骤】(1)将5ml菌液分次装入同一1.5mlEP管中，3000r/min离心5min,以收集菌体。

(2)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡5min。

(3)加200μl新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，不可强烈振荡，放置于冰上3min左右。

小提质粒说明书

小提质粒说明书

小提质粒说明书tiangen质粒小型提取试剂盒说明书（离心柱目录号dp103）（版本号dp121221）本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的dna。

离心吸附柱中采用的硅基质材料为新型材料，高效、专一吸附dna。

质粒提取得率和质量与宿主菌的种类和培养条件，细胞的裂解，质粒拷贝数，质粒的稳定性，抗生素等因素有关。

使用前注意：1.使用前将RNaseA加入溶液P1中（加入试剂盒中提供的所有RNaseA），搅拌均匀，并储存在2-8℃下。

2第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液pw中加入无水乙醇。

3.使用前请检查平衡液BL、P2、P3是否混浊。

如果有任何混浊，可以在37℃的水浴中加热几分钟，以恢复澄清。

4.注意不要直接接触溶液p2和p3，使用后应立即盖紧盖子。

5.所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000rpm(~13,400×g)。

6.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。

7.实验前，吸附柱的平衡液BL处理能最大程度地活化硅基膜，提高产率。

8.平衡液BL处理过的柱应在同一天使用，放置时间过长会影响效果。

9.去蛋白液pd可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为enda+（tg1、bl21、hb101、et12567、jm系列）等核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液pd。

操作步骤：1.柱平衡：吸附柱cp3500μLBL，12000rpm，离心1min，将收集管中的废液倒出，将吸附柱放回回收集管。

（使用当天处理的柱）2.取1ml过夜培养的菌液，加入离心管，12,000rpm，离心1min，尽量吸除上清（多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3.向离心管中加入250，用于细菌沉淀μL溶液P1、悬浮液、混合和沉淀。

（如果存在未充分混合的细菌，将影响裂解，导致萃取量和纯度低）4.加入250μl溶液p2，温和的上下翻转6-8次，使菌体充分裂解。

质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)

质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)

回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到-20℃，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase（50ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
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质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
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很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。