Livin和PCNA在口腔鳞癌浸润前沿中的表达和临床意义
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７ｌ２· 徐州医学院学报ＡＣＴＡ ＡＣＡＤＥＭＩＡＥ ＭＥＤＩＣＩＮＡＥ ＸＵＺＨＯＵ ２０１０，３０（１ １） Ｌｉｖｉｎ和ＰＣＮＡ在口腔鳞癌浸润前沿中的表达和临床 李向新 ，蒋蕾¨，白玲。，张来健 ，张昶。 意义
（１．连云港市第一人民医院口腔科，江苏连云港２２２０００；２．连云港市第一人民医院病理科） 摘要：目的检测凋亡抑制蛋白Ｌｉｖｉｎ和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）在口腔鳞癌浸润前沿和非前沿中的表达， 探讨其在口腔鳞癌发生发展过程中的意义及两者相关性。方法对４８例口腔鳞癌浸润前沿和非前沿部分分别 进行病理分级，应用免疫组化Ｍａｘ—ＶｉｓｉｏｎＴＭ，陕捷二步法检测Ｌｉｖｉｎ和ＰＣＮＡ在口腔鳞癌浸润前沿及非前沿部分 的表达情况，并进行统计学分析。结果４８例口腔鳞癌浸润前沿和非前沿病理分级情况有显著性差异（Ｐ＜ ０．０１）；Ｌｉｖｉｎ和ＰＣＮＡ在浸润前沿中的表达强度明显高于非前沿部分（Ｐ＜０．０１）；Ｌｉｖｉｎ表达阳性的口腔鳞癌组织 ＰＣＮＡ标记指数（ＬＩ）高于Ｌｉｖｉｎ表达阴性者（Ｐ＜０．０１），Ｌｉｖｉｎ的表达与ＰＣＮＡ呈正相关（ ＝０．３９８，Ｐ＝０．０１６）。 结论口腔鳞癌浸润前沿肿瘤细胞凋亡抑制现象和增殖活性明显高于非前沿部分。浸润前沿中Ｌｉｖｉｎ和ＰＣＮＡ 的高表达可以反映肿瘤的高恶性度和高复发转移倾向。 关键词：口腔肿瘤；鳞状细胞癌；浸润前沿；Ｌｉｖｉｎ；增殖细胞核抗原 中图分类号：Ｒ７３９．８５ 文献标志码：Ａ 文章编号：１０００—２０６５（２０１０）１１—０７１２—０４
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｌｉｖｉｎ ａｎｄ ＰＣＮＡ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｆｒｏｎｔ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ
ＬＩ Ｘｉａｎｇｘｉｎ ，ＪＩＡＮＧ Ｌｅｉ ，ＢＡＩ Ｌｉｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｌａｉｊｉａｎ‘，ＺＨＡＮＧ Ｃｈａｎｇ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ Ｆｉｒｓｔ Ｐｅｏｐｌｅ Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２２０００，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ Ｆｉｒｓｔ Ｐｅｏｐｌｅ Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａ１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｌｉｖｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ （ＰＣＮＡ）ａｔ ｔｈｅ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｆｒｏｎｔ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｌｉｖｉｎ ａｎｄ ＰＣＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒｔｙ—ｅｉｇｈｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｅｒｅ ｇｒａｄｅｄ ｂｙ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｆｒｏｎｔ ｇｒａｄｉｎｇ（ＩＦＧ）ｉｎｔｏ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｆｒｏｎｔ（ＩＴＦ）ａｎｄ ｎｏｎ—ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｆｒｏｎｔ（ｎｏｎ—ＩＴＦ）ｉｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｉｎ ａｎｄ ＰＣＮＡ ｉｎ ｂｏｔｈ ＩＴＦ ａｎｄ ｎｏｎ ＩＴＦ ｗａｓ ｅ— ｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｔｗｏ—ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ（Ｍａｘ～Ｖｉｓｉｏｎ ）ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｈｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔ Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＩＴＦ ａｎｄ ｎｏｎ—ＩＴＦ ｏｆ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｒａｄｉｎｇ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｉｎ ａｎｄ ＰＣＮＡ ａｔ ｔｈｅ ＩＴＦ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ—ＩＴＦ（Ｐ＜ ０．０１）．Ｔｈｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘ（ＬＩ）ｏｆ ＰＣＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｉｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｉｎ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＣＮＡ（ｒ ＝０．３９８，Ｐ：０．０１６）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｔ ｔｈｅ ＩＴＦ ｉｎ ｏｒａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉ— ｃａｎｔ ｔｈａｎ ａｔ ｔｈｅ ｎｏｎ—ＩＴＦ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｌｉｖｉｎ ａｎｄ ＰＣＮＡ ａｔ ｔｈｅ ＩＴＦ ｍａｙ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｔｒｅｎｄ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍａｌｉｇ— ｎａｎｃｙ，ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｏｒａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ｓｑｕａｌｎｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｆｒｏｎｔ；ｌｉｖｉｎ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ
肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡失衡所致，凋亡 抑制是肿瘤发生的重要机制。而肿瘤的浸润是肿瘤 的某些物质或细胞在质和量方面异常分布于组织间 隙的现象 ］，是肿瘤实现远处转移的第一个步骤。 浸润前沿是指位于肿瘤与宿主组织或器官交界处最 基金项目：连云港市卫生局科研项目（０８００３） 通信作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｌｊｌ８＠１６３．ｃｏｒｎ 前沿的３～６层肿瘤细胞或分散的细胞团。研究肿 瘤浸润前沿细胞的生物学特性对于客观评估肿瘤的 预后有重要意义。 Ｌｉｖｉｎ是最近发现的凋亡抑制蛋白家族中的新 成员，可能在肿瘤的发生和发展中起重要作用。我 徐州医学院学报ＡＣＴＡ ＡＣＡＤＥＭＩＡＥ ＭＥＤＩＣＩＮＡＥ ＸＵＺＨＯＵ ２０１０，３０（１１） 们将凋亡抑制蛋白Ｌｉｖｉｎ和增殖细胞核抗原（ＰＣ－ ＮＡ）同时引入口腔黏膜鳞癌的研究，以期能了解其 在肿瘤发生发展中的作用。
１材料和方法 １．１ 标本来源 选择徐州医学院附属连云港市第 人民医院口腔科２００１．－２００８年手术切除并经病理 证实为口腔黏膜鳞癌标本４８例，所有病例术前均未 接受过放化疗等特殊抗肿瘤治疗。其中男２９例、女 １９例，年龄３６—７９岁，平均５８．２岁；组织来源于舌２３ 例，颊５例，口底３例，牙龈１０例，腭７例；有局部淋 巴结转移６例，无转移４２例；Ｉ期６例，醐１４例，Ⅲ期 １６例，Ⅳ期１２例。选择距肿瘤１．５ ｃｍ以上病理证实 为阴性的口腔黏膜组织作为正常对照。 １．２主要试剂及仪器兔抗人Ｌｉｖｉｎ多克隆抗体购 自武汉博士德公司（ＢＡ１７４３），工作浓度１：１００；鼠抗 人ＰＣＮＡ单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有 限公司，为即用型；Ｍａｘ—Ｖｉｓｉｏｎ 试剂盒和ＤＡＢ显 色剂均购自福州迈新生物技术有限公司。仪器：普 通实验室冰箱、切片机、烤片机、高压锅、温育箱、湿 盒、恒温振荡器、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１显微镜、显微数码照 相机Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４０Ｆ４、ＰＡＳ９００图像分析系统等。 １．３方法对已有苏木精一伊红染色切片进行组 织学观察，对浸润前沿及非前沿部位分别进行组织 病理分级。免疫组化方法：常规石蜡制片，切片厚度 ３—４ ｍ，采用免疫组化Ｍａｘ—Ｖｉｓｉｏｎ Ｍ．陕捷二步法 检测Ｌｉｖｉｎ、ＰＣＮＡ蛋白的表达，严格按试剂盒说明书 进行操作。 １．４结果判定Ｌｉｖｉｎ表达主要位于细胞质，以出 现清晰的棕黄色颗粒作为阳性结果判定，综合考虑 切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比及显 色程度。阳性细胞百分比分为４级：≤５％为０分； ６％～２５％为１分；２６％～５０％为２分；≥５１％为３ 分。根据显色程度判定阳性强度：基本不着色为０ 分；淡黄色为１分；棕黄色为２分；棕褐色为３分。 将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相 乘，为最后得分。０～１分为阴性（一）；２～３分为弱 阳性（＋）；４～６分为中等阳性（＋＋）；６分以上为 强阳性（＋＋＋）。ＰＣＮＡ表达定位于细胞核，出现 清晰的棕黄色颗粒为阳性。采用ＰＣＮＡ标记指数 （１ａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘ，ＬＩ），即每例在镜下随机取４个区， 每区分别计数２００个细胞的阳性细胞率，取均值作 为ＬＩ，来进行计算。 １．５统计学处理应用ＳＰＳＳ １７．０软件进行统计 分析。进行配对设计的秩和检验和ｔ检验，两者相 关性采用Ｓｐｅａｒｍａｎ等级相关分析。Ｐ＜０．０５为差 异有显著性。
２结果 ２．１ 组织学观察光镜下同一标本不同部位细胞分 化程度存在差异，位于浸润前沿的肿瘤细胞通常具有 低分化、高离散的特征，与中心或近表面部分的肿瘤细 胞相比，浸润前沿的组织分化较非前沿部分差（图１）。 浸润前沿和非前沿病理分级差异有显著性（Ｐ＜０．０１）， 浸润前沿的组织分化较非前沿部分差（表１）。
图１ 口腔鳞癌浸润前沿和非前沿的组织学观察（苏木精一伊红染色，×２００） Ａ．非前沿；Ｂ．浸润前沿
表１ 口腔鳞癌浸润前沿和非前沿病理分级（ｎ＝４８，例） ２．２ Ｌｉｖｉｎ蛋白的表达Ｌｉｖｉｎ蛋白主要定位于细 胞质，阳性染色为粗细均一的棕黄色颗粒。本实验 中所有正常口腔黏膜均为阴性表达，４８例口腔鳞癌 组织在浸润前沿Ｌｉｖｉｎ的表达强度明显高于非前沿
