免疫荧光技术的原理、分类及应用ppt课件

妊娠期
甲硝唑500mg，口服，2次/d，共7d
甲硝唑250mg，口服，3次/d，共7d
氯洁霉素300mg，口服，2次/d，共7d
哺乳期
选择局部用药，尽量避免全身用药
奈瑟氏淋球菌
1.临床意义
造成淋病的病原微生物，引发以泌尿生殖道化脓性炎症为
主要临床症状的性传播疾病 淋病是常见的性传播疾病之一，且发病率呈上升趋势，已 构成威胁公众健康的重大疾病 妊娠期感染淋病对母婴危害极大，宫内感染易致自然流产、 早产及胎儿宫内发育迟缓 分娩时母婴垂直传播，可致新生儿淋病性结膜炎，治疗若 不及时彻底，新生儿有致盲的危险 淋病孕妇产后易发生散播性淋病
背景复杂易漏检需要实验者具备丰富的实践经验寻找足够数量的线索细胞不具备特异性阴道加德纳菌免疫荧光法94539751操作简便检测时间短可直接检测出主要致病菌标本需要量少特异性强结果判断直观灵敏度高等优点直接检测病原微生物检测意义清晰2019121616阴道加德纳菌阳性图片2019121617治疗方案非孕期推荐方案甲硝唑500mg口服2次d共7d075甲硝唑膏5g阴道上药2次d共5d2克林霉素膏5g阴道上药1次晚共7d替代方案克林霉素300mg口服2次d共7d克林霉素栓300g阴道上药1次晚共3d2019121618妊娠期氯洁霉素300mg口服2次d共7d哺乳期选择局部用药尽量避免全身用药2019121619奈瑟氏淋球菌造成淋病的病原微生物引发以泌尿生殖道化脓性炎症为主要临床症状的性传播疾病淋病是常见的性传播疾病之一且发病率呈上升趋势已构成威胁公众健康的重大疾病妊娠期感染淋病对母婴危害极大宫内感染易致自然流产早产及胎儿宫内发育迟缓分娩时母婴垂直传播可致新生儿淋病性结膜炎治疗若不及时彻底新生儿有致盲的危险淋病孕妇产后易发生散播性淋病1

❖ 分析细胞受体 对细胞受体进行定量定性分析，可做单细胞测定， 也可从分析中剔除死亡细胞
❖ 分析肿瘤细胞的DNA、RNA含量 FCM在肿瘤学上的应用主要是利用DNA含量的测定 进行包括癌前病变及早期癌变的检出，指导化疗以 及预后评估等工作。
❖ 分析免疫细胞的功能 分离纯化的细胞群可用于多种细胞各功能的分析 例淋巴细胞和靶细胞共同培养后，可利用PI能渗透 到死细胞致核染色的特点，分析死亡靶细胞的比例， 了解淋巴细胞的细胞毒活性
数据处理系统：存储、显示、分析系统（计算机）
二.光信号的测定
❖ 散射光的测定 激光束上的低角度散射光被称为前
向散射光(FS)，主要反映细胞的大小；与激光束成 90度角收集的散射光信号称侧向散射光(SS)，主要
反映细胞的颗粒特性。
❖ 荧光 细胞亦可发出荧光(FL)
*最常用于单克隆抗体标记的三种荧光染料 FITC PE 藻红蛋白-得州红
❖ 免疫检测样品的制备 ❖ 细胞悬液的保存 ❖ 荧光染色 ❖ 细胞自发荧光 ❖ 质量控制
免疫检测样品的制备
❖ 外周血淋巴细胞样品的制备
常用淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞
❖ 培养细胞的样品制备
悬浮生长—直接吹打 贴壁生长—蛋白消化酶+机械敲打+400目尼龙网过滤
❖ 新鲜组织细胞悬液的制备
机械法—剪碎法、网搓、研磨 酶处理法 –胰蛋白酶、胶原酶、胃蛋白酶 化学试剂处理法—EDTA 表面活性剂—破坏膜结构
什么是 FCM ？
流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快 速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、 快速的定量分析及分选的技术
激光技术+流体力学+光电测量技术+计 算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗 体技术

• 超顺磁性.
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6碳纳米管
• 碳纳米管( carbon nanotubes，CNTs) 的结构可看成 是石墨的六角形网格结构发生一定弯曲而形成的空间 拓扑结构。
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• CNTs 作为生物 分子标志物的 原理与胶体金 类似，其明显 的黑色在定性 或半定量检测 中肉眼即可见。
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• 目前无论用何种方法制备 CNTs，均难以去 除其中混杂的无定形碳、石墨碳碎片等杂 质，这些杂质与 CNTs 混杂在一起，严重 限制了 CNTs的研究与应用[1].
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• 胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗 粒表面的过程。
• 由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一 个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使 胶体金处于稳定状态。
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• 胶体金作为标志物有以下优势: • ①几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单，
效率高，用量少，便宜，基本不改变被标 记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便， 保质期长。 • ②不同直径的纳米金可以用于多重标记。 • ③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼 观察。
待
层析方向
免疫反应
测
物
T
C
免疫层析技术基本原理示意图
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荧光（fluorescence）
• 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃
迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式 释放出能量，称为荧光。
发射光谱和激发光谱
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下
记录的样品发射荧光的强度。
激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波
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5纳米磁性颗粒
• 纳米磁性颗粒( magnetic nanoparticle，MNs) 也被称为超顺磁颗粒，它结合了磁性粒子和纳米 材料的优点，具有粒径小、超顺磁性和比表面积 大等特性。

酶底物产物激发光发射光 Β-G MUG MU 360 450 AP MUP MU 360 450 HRP HPA二聚体 317 414 ⑷合适荧光素的选择 1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 荧光素-N=C +NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质 ‖ ︱ ︱‖ ︱ S H H SH 2）荧光效率高，标记后下降不明显。 3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
实验步骤
直接法测抗 原
间接法测抗 体
⑴基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查 和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 ⑵试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架
1）荧光色素
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有 机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
⑴异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶 剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490--495nm，最大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结 构式如下：
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生 反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。