[收稿日期]2019-05-30 [修回日期]2020-02-01[基金项目]四川省干部保健科研课题(川干研2016⁃706)[作者单位]成都医学院第一附属医院产科,四川成都610500[作者简介]张 静(1981-),女,主治医师.[文章编号]1000⁃2200(2020)07⁃0876⁃04㊃临床医学㊃TRAIL 与PGRMC1在胎膜早破孕妇胎膜组织中表达水平及临床意义张 静,张 成,唐国珍,马俊如,裴娇娇,吴 君,罗 希,谭春梅[摘要]目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导体(TRAIL)与孕酮受体膜组件1(PGRMC1)在胎膜早破(PROM)孕妇胎膜组织中的表达水平及临床意义㊂方法:抽取产科因足月PROM 行剖宫产术结束妊娠的60例孕妇(PROM 组),分娩后胎盘病理检查是否伴有绒毛膜羊膜炎(CAM);另抽取同期行剖宫产分娩的60例健康孕妇(对照组),均以免疫组织化学法㊁Western blotting 法检测胎膜组织中TRAIL㊁PGRMC1蛋白表达情况㊂结果:TRAIL㊁PGRMC1均主要表达于胎膜的绒毛膜层与蜕膜层㊂与对照组相比,PROM 组孕妇胎膜组织中TRAIL 阳性表达率明显升高(P <0.01),PGRMC1表达率明显降低(P <0.01);且胎膜组织中TRAIL 蛋白相对表达量明显升高(P <0.01),PGRMC1蛋白相对表达量明显降低(P <0.01)㊂PROM 孕妇中发生CAM 者胎膜组织TRAIL㊁PGRMC1阳性表达率与未发生CAM 者相比差异无统计学意义(P >0.05),而发生CAM 者TRAIL 蛋白相对表达量明显高于未发生CAM 者(P <0.01),PGRMC1蛋白相对表达量明显低于未发生CAM 者(P <0.01)㊂结论:PROM 孕妇胎膜组织中存在TRAIL 蛋白高表达,PGRMC1蛋白低表达,二者在PROM 发病中发挥重要作用,且与CAM 有一定关联,可作为临床检查诊断的参考指标㊂[关键词]胎膜早破;肿瘤坏死因子相关凋亡诱导体;孕酮受体膜组件1;胎膜组织[中图法分类号]R 714.433 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2020.07.009Expression levels and clinical significance of TRAIL and PGRMC1in fetal membrane tissue of pregnant woman with premature rupture of membranesZHANG Jing,ZHANG Cheng,TANG Guo⁃zhen,MA Jun⁃ru,PEI Jiao⁃jiao,WU Jun,LUO Xi,TAN Chun⁃mei(Department of Obstetrics ,The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College ,Chengdu Sichuan 610500,China )[Abstract ]Objective :To investigate the expression levels and clinical significance of tumor necrosis factor⁃related apoptosis inducing ligand(TRAIL)and progesterone receptor membrane component 1(PGRMC1)in fetal membrane tissues of pregnant woman with premature rupture of membranes(PROM).Methods :Sixty pregnant women treated with cesarean section because of full⁃term PROM to stop the pregnancy in obstetrics department were set as the PROM group.After delivery,the chorioamnionitis(CAM)in PROM group were identified using placenta pathological examination.Sixty healthy pregnant women treated with cesarean delivery in the same periodwere set as the control group.The expression levels of TRAIL and PGRMC1protein in fetal membrane tissues were detected using the immunohistochemistry and Western blotting,and analyzed using statistical method.Results :The TRAIL and PGRMC1were mainly expressed in chorion and decidua layers of pared with the control group,the positive expression rates of TRAIL and PGRMC1in fetal membrane tissues in PROM group significantly increased and decreased,respectively (P <0.01).The relative expression levels of TRAIL and PGRMC1protein in fetal membrane tissues in PROM group significantly increased and decreased compared with the control group,respectively(P <0.01).The differences of the positive expression rates of the TRAIL㊁PGRMC1infetal membrane tissues of PROM pregnant women with or without CAM were not statistically significnat (P >0.05).The relative expression level of TRAIL protein in patients with CAM was significantly higher than that in patients without CAM(P <0.01),while the relative expression level of PGRMC1in patients with CAM was significantly lower than that in patients without CAM (P <0.01).Conclusions :The expression levels of TRAIL and PGRMC1proteins in fetal membrane tissues of PROM pregnant women are high and low,both play an important role in the pathogenesis of PROM,and are related to CAM,which can be used as a reference index forclinical examination and diagnosis.[Key words ]premature rupture of membrane;tumor necrosis factor⁃related apoptosis inducing ligand;progesterone receptor membranecomponent 1;fetal membrane tissue 胎膜早破(premature rupture membranes,PROM)指发生于临产前的胎膜自然破裂,妊娠未达37周的PROM 又称为未足月PROM,均与绒毛膜羊膜炎(chorioamnionitis,CAM)有关[1]㊂据报道[2],我国PROM发生率为3.00%~7.00%,美国(发生率为5.00%~15.00%)等部分发达地区PROM发生率更高,其已成为世界范围孕妇围生期多发的并发症㊂既往报道[3-4]显示,约30%的早产与未足月PROM有关,PROM引起的直接危害为诱发宫缩引起早产,由于PROM发生后胎膜屏障作用消失,可引起CAM㊁羊水减少㊁胎儿宫内窘迫㊁新生儿败血症㊁黄疸㊁宫内感染及产褥感染等不良结局㊂PROM 的确切机制尚未完全阐明㊂肿瘤坏死因子相关凋亡诱导体(tumor necorosis factor⁃related apoptosis inducing ligand,TRAIL)与孕酮受体膜组件1 (progesterone receptor membrane component1, PGRMC1)对机体的生理㊁病理均起到广泛调节作用,可维持正常妊娠过程,如细胞分化与凋亡㊁子宫收缩等[5-6],二者是否与PROM㊁CAM有关尚在研究阶段㊂本研究观察PROM孕妇胎膜组织中TRAIL㊁PGRMC1蛋白表达情况,并探讨其与PROM 发病及CAM的关系㊂1 资料与方法1.1 一般资料 回顾性抽取2018年5月至2019年3月我院产科因足月PROM行剖宫产术结束妊娠的60例孕妇为PROM组,均为自然㊁单胎妊娠,符合PROM相关诊断要求[7],年龄20~36岁;孕前体质量指数(body mass index,BMI)19~29kg/m2;孕周37~40周;孕次1~3次㊂另抽取同期行剖宫产分娩的60例健康孕妇为对照组,剖宫产指征为胎位异常㊁骨盆狭窄,年龄21~37岁;孕前BMI19~30kg/ m2;孕周37~40周;孕次1~3次㊂2组孕妇上述基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1),且均无其他母体疾病㊁产科并发症㊂表1 2组孕妇一般资料比较(x±s)分组n年龄/岁 孕前BMI/(kg/m2)孕周/周孕次/次PROM组6028.32±5.4023.40±2.2739.03±1.71 1.85±0.40对照组6028.55±6.0023.56±3.1339.79±1.80 1.81±0.36t 0.230.32 1.370.58P >0.05>0.05>0.05>0.05 1.2 CAM病理诊断 以PROM组分娩后病理检查显示中性粒细胞浸润绒毛膜㊁羊膜㊁蜕膜或脐带中任意一组织即诊断为CAM[7]㊂1.3 胎膜组织中TRAIL㊁PGRMC1检测 1.3.1 标本收集及处理 2组胎盘娩出后均取胎膜破口处至胎盘边缘的胎膜组织,约1cm×4cm,冷0.9%氯化钠溶液充分冲洗表面血迹,使其卷成胎膜卷以大头针固定,平均裁分为两部分,一部分置于10%中性甲醛的容器内固定,另一部分直接置于冻存管后迅速存放于液氮中㊂1.3.2 免疫组织化学检测 将中性甲醛固定的标本切成厚约3mm小块,常规石蜡包埋㊁连续切片(厚4μm)处理,之后遵照常规制片步骤完成缓冲液冲洗㊁一抗与二抗孵育㊁DAB显色㊁乙醇脱色㊁梯度乙醇脱水㊁抗原修复㊁透明㊁中性树胶封片等操作㊂于光学显微镜下以双盲法观察阳性反应,阴性为0分,阳性细胞≤10%㊁11%~50%㊁51%~75%㊁≥75%分别记1分㊁2分㊁3分㊁4分;无染色为0分,染色强度为淡黄色㊁棕黄色㊁棕褐色分别记1分㊁2分㊁3分;最终以阳性细胞百分比㊁染色强度积分的乘积>3分为TRAIL㊁PGRMC1表达阳性㊂1.3.3 Western blotting检测 存放于液氮的组织标本清洗后称重,按体积比1∶5~1∶10的比例加入适量氯化钠溶液,将其剪碎,超声粉碎机粉碎后加蛋白裂解液4℃过夜,离心后取上清,分装后于-70℃冻存;BCA法检测蛋白浓度,随后以SDS⁃PAGE电泳分离蛋白并转移至PVDF膜,脱脂牛奶溶液封闭1h,TRAIL㊁PGRMC1一抗(分别按1∶1000㊁1∶800稀释)㊁二抗孵育后以1×TBST充分洗膜3次,最后以HRP⁃ECL发光法显影,以β⁃actin 为内参分析TRAIL㊁PGRMC1蛋白的相对表达量㊂1.4 统计学方法 采用χ2检验和t检验㊂2 结果2.1 2组TRAIL㊁PGRMC1阳性表达率的比较 TRAIL㊁PGRMC1均主要表达于胎膜的绒毛膜层与蜕膜层㊂与对照组相比,PROM组孕妇胎膜组织中TRAIL阳性表达率明显升高(P<0.01),PGRMC1表达率明显降低(P<0.01)(见图1~2㊁表1)㊂2.2 2组TRAIL㊁PGRMC1蛋白相对表达量的比较 与对照组相比,PROM组孕妇胎膜组织中TRAIL蛋白相对表达量升高(P <0.01),PGRMC1蛋白相对表达量明显降低(P <0.01)(见图3㊁表2)㊂ 表1 2组TRAIL ㊁PGRMC1阳性表达率的比较[n ;百分率(%)]分组n TRAIL PGRMC1PROM 组6044(73.33)9(15.00)对照组6011(18.33)49(81.67) χ2 36.5553.39P<0.01<0.01表2 2组TRAIL ㊁PGRMC1蛋白相对表达量的比较(x ±s )分组n TRAIL PGRMC1PROM 组60 1.54±0.140.65±0.12对照组60 1.03±0.09 1.10±0.13t 23.7419.70P<0.01<0.012.3 PROM 孕妇胎膜组织TRAIL ㊁PGRMC1表达与CAM 的关系 PROM 孕妇中,共有17例(28.33%)发生CAM㊂发生CAM 者胎膜组织TRAIL㊁PGRMC1阳性表达率与未发生CAM 者差异均无统计学意义(P >0.05);而发生CAM 者TRAIL 蛋白相对表达量明显高于未发生CAM 者(P <0.01),PGRMC1蛋白相对表达量明显低于未发生CAM 者(P <0.01)(见表3)㊂ 表3 PROM 孕妇胎膜组织TRAIL ㊁PGRMC1表达与CAM的关系[n ;百分率(%)]分组n 阳性表达率 TRAIL PGRMC1 相对表达量 TRAIL PGRMC1 发生CAM1713(76.47)2(11.76) 1.67±0.240.51±0.08未发生CAM 4331(72.09)7(16.28) 1.42±0.170.73±0.15χ2 0.120.20 4.55* 5.71*P>0.05>0.05<0.01<0.01 *示t 值3 讨论 胎膜由内层(羊膜)㊁外层(绒毛膜)及蜕膜层构成,其中绒毛膜内含丰富血管,并通过弥散作用为羊膜提供氧气及营养物质,现阶段已证实胎膜结构紊乱㊁薄弱及胎膜局部微环境的改变与PROM 密切相关[8]㊂值得关注的是,TRAIL 属于肿瘤坏死因子家族的成员,可高序列同源性诱导凋亡,已明确广泛分布于宫颈㊁肺㊁乳腺㊁卵巢等不同类型细胞㊁组织中,对调节细胞凋亡㊁分化㊁生长㊁增殖过程及免疫监视等生理过程发挥重要作用[9]㊂近年来,有学者发现TRAIL 在妊娠期胎膜中有一定表达,储存于羊膜㊁绒毛膜腔中,其与胎膜结构及局部微环境改变有一定联系[9]㊂PGRMC1蛋白的相对分子质量为25000~28000,且含有一段短的跨膜序列与一段细胞色素b5结合区域,可参与或影响妊娠期间类固醇生成㊁子宫收缩等过程,有学者认为其对稳定妊娠期胎膜㊁胎盘的自我环境有重要作用[10]㊂本研究以免疫组织化学法㊁Western blotting 法检测胎膜组织中TRAIL㊁PGRMC1蛋白表达情况,结果显示TRAIL㊁PGRMC1均主要表达于胎膜的绒毛膜层与蜕膜层;同时与对照组相比,PROM 组孕妇胎膜组织中TRAIL 阳性表达率显著增高,PGRMC1表达率明显降低;且PROM 组孕妇胎膜组织中TRAIL 蛋白相对表达量显著增高,PGRMC1蛋白相对表达量明显降低,提示PROM 孕妇胎膜组织中尤其是绒毛膜㊁蜕膜层存在TRAIL 蛋白高表达,PGRMC1蛋白低表达,可能参与PROM 发病㊂崔世红等[11]研究显示,PROM 孕妇胎膜组织中TRAIL 蛋白表达阳性率达87%,TRAIL mRNA 相对表达量为(1.62±0.18),均明显高于正常孕妇的(0.99±0.17),认为TRAIL 参与PROM 发病过程的可能机制在于TRAIL过表达可影响组织活性细胞水平㊁胶原纤维合成及细胞外基质沉积,引起胎膜韧性减退与构象变化,尤其是胎膜局部组织更为薄弱,易破裂㊂曹征然等[12]强调,研究机体在血氧供应缺乏㊁氧化/抗氧化失衡及炎症反应下易引发氧化应激,继而易导致胎膜细胞过度凋亡及细胞外基质减少,从而引起胎膜功能㊁结构改变;该研究中PROM孕妇胎盘组织TRAIL阳性表达率达90.00%,且TRAIL mRNA与调控核转录因子⁃kB mRNA表达具有相关性,认为二者协同作用可调控胎膜组织细胞,导致胎膜㊁胎盘组织出现氧化应激及免疫反应,进而促使胎膜细胞过量凋亡而出现PROM㊂上述两项研究均从不同角度支持了本研究观点㊂对于胎膜组织PGRMC1表达与PROM 的关系,程国梅等[13]研究发现,PROM孕妇胎膜组织胎膜破裂区㊁胎盘组织中PGRMC1蛋白表达明显低于正常孕妇对应胎膜组织区域,推测PGRMC1低表达参与了PROM发病㊂张琳瑛等[14]认为正常情况下PGRMC1在绒毛膜㊁羊膜细胞中呈高表达,可介导孕酮对肿瘤坏死因子⁃α诱导基质金属蛋白酶⁃9活性的抑制效应;相反,若PGRMC1表达下降,可直接或间接影响胎膜细胞凋亡与细胞外基质降解㊁重塑,继而诱发PROM㊂国外学者ALLEN等[15]通过用siRNA沉默PGRMC1表达,结果导致HTR8/ SVneo细胞醋酸甲羟孕酮抑制肿瘤坏死因子⁃α诱导基质金属蛋白酶⁃9表达的能力显著下降,与前一学者的观点类似,但具体机制仍需深入探究㊂此外,CAM与发生PROM相互影响,尤其发生PROM后,孕妇生殖道上行感染风险显著增加,随着PROM时间延长,CAM风险越高[16]㊂本研究发现, PROM孕妇中,共有17例(28.33%)发生CAM,进一步提示PROM孕妇具有高CAM风险㊂更重要的是,发生CAM者TRAIL蛋白相对表达量明显高于未发生CAM者,PGRMC1蛋白相对表达量明显低于后者,造成前者胎膜组织TRAIL㊁PGRMC1阳性表达率与后者无显著差异的原因可能为入选PROM及合并CAM的孕妇样本量较少,仍可提示PROM孕妇胎膜组织中TRAIL高表达及PGRMC1低表达与CAM有一定关联㊂推测可能机制在于TRAIL㊁PGRMC1参与监视及介导免疫应答,PROM发生后大量炎症因子释放,中性粒细胞被活化,更易发生生殖道感染及CAM㊂总之,胎膜组织TRAIL蛋白高表达及PGRMC1蛋白低表达可能在妊娠期PROM中发挥重要作用,且可能为PROM孕妇发生CAM的重要原因之一,临床检查时可考虑将TRAIL㊁PGRMC1纳入PROM 的辅助诊断,必要时可借助其评估CAM风险,但相关结论仍需扩大样本量㊁多中心的研究论证㊂[参考文献][1] 包翠梅,杨梅.产妇血清IL⁃6㊁sICAM⁃1㊁CRP水平与未足月胎膜早破的相关性研究[J].标记免疫分析与临床,2018,25(12):1857.[2] 郑文佩,张志涛,庄艳艳,等.2013年全国多中心双胎胎膜早破临床分析[J].中国实用妇科与产科杂志,2017,33(2):191.[3] 李雯,常颖,李星,等.基质金属蛋白酶降解胞外基质致未足月胎膜早破研究进展[J].国际妇产科学杂志,2016,43(1):8. [4] 徐晓英,牛建丽,谢志平,等.外周血中细胞因子表达水平与孕妇胎膜早破及新生儿围产期感染的相关性研究[J].中华医院感染学杂志,2017,27(19):4507.[5] 邓睿,刘杰,林佳,等.胎膜早破孕妇胎膜组织中HLA⁃G㊁MMP⁃9的表达及意义[J].中国妇幼保健,2018,33(20):4575.[6] PIEL RB,SHIFERAW MT,VASHISHT AA,et al.A novel rolefor progesterone receptor membrane component1(pgrmc1):apartner and regulator of ferrochelatase[J].Biochemistry,2016,55(37):5204.[7] 谢幸,苟文丽.妇产科学[M].8版.北京:人民卫生出版社,2013:133.[8] ENDALE T,FENTAHUN N,GEMADA D,et al.Maternal andfetal outcomes in term premature rupture of membrane[J].WorldJ Emerg Med,2016,7(2):147.[9] YU H,WANG X,GAO H,et al.Perinatal outcomes of pregnanciescomplicated by pretermpremature rupture of the membranes before34weeks of gestation in a tertiary center in China:A retrospectivereview[J].Biosci Trends,2015,9(1):35.[10] MENG Y,MURTHA AP,FENG L.Progesterone,inflammatorycytokine(TNF⁃α),and oxidative stress(H2O2)regulateprogesterone receptor membrane component1expression in fetalmembrane cells[J].Reprod Sci,2016,23(9):1168. [11] 崔世红,陈娟,孙俊燕,等.胎膜早破产妇胎膜组织中TRAIL㊁MMP⁃2基因及蛋白表达变化[J].山东医药,2015,55(27):36.[12] 曹征然,丁屹.胎膜早破孕妇胎膜组织中TRAIL㊁NF⁃κB的表达及意义[J].中国计划生育和妇产科,2018,10(6):75. [13] 程国梅,张琳瑛,郝志伟,等.胎膜早破孕妇胎膜不同区域及胎盘组织中孕酮膜受体组件1的表达[J].郑州大学学报(医学版),2016,51(3):378.[14] 张琳瑛.胎膜早破孕妇胎膜组织不同区域PGRMC1㊁MMP⁃9的表达及意义[D].郑州:郑州大学,2016.[15] ALLEN TK,FENG L,GROTEGUT CA,et al.Progesteronereceptor membrane component1as the mediator of the inhibitoryeffect of progestins on cytokine⁃induced matrix metalloproteinase9activity in vitro[J].Reprod Sci,2014,21(2):260. [16] 钟其梅,王岚,陈真,等.胎膜早破孕妇发生胎盘组织学绒毛膜羊膜炎的临床危险因素分析[J].重庆医学,2018,47(19):2571.(本文编辑 刘畅)。
