肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型实验室检测研究进展
- 格式：pdf
- 大小：125.41 KB
- 文档页数：3
1878
职业与健康 2009年 9月第 25卷第 17期 Occup and Health Vol. 25 No. 17 Sep 2009
肠道病毒 71型和柯萨奇病毒 A组 16型 实验室检测研究进展
Current Progress in M ethods for Laboratory Detection of Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16
1879
和 CoxA 16病毒特异性核苷酸设计不同的引物 ,进行 RT2PCR 反应 ,对 EV 71和 CoxA 16病毒进行检测和鉴别诊断 ,己成为公 共卫生实验室快速诊断 EV 71和 CoxA 16流行及其分子流行病 学特征的重要手段 。
EV 71和 CoxA16VPl基因具有与病毒血清型完全对应的遗 传多样性 ,其基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分 类的依据 ,并可作为小 RNA 病毒科内不同属的分类参考 [728 ] ,肠 道病毒的 5’端非编码区 (5’2UTR)的属特异性可以区分肠道病 毒与其他小 RNA病毒 ,与血清型也有一定的相关性 ,因此 ,近年 来 EV 71 和 CoxA 16 引物设计主要针对 VPl和 5’2UTR 区域 。 例如 Shinohara等 [9 ]曾报道 ,通过 3 个步骤鉴别 EV7 1 和 CoxA 16,病毒分离后 ,使用引物 Primer 2 / E 33进行 RT2PCR 扩增 ,最 后使用限制性内切酶 TaqⅠ和 EcoT 22Ⅰ进行酶切 , EV 71产物 不能被酶切而 CoxA 16产物均能酶切 ,从而达到检测和鉴别这 2 种病毒的目的 。 Sinch等 [10 ]基于 EV 71的 VP1区域设计了一对 引物 ( VP1F2 和 VPlR2 ) , 杨 洪 等 [11 ] 使 用 两 对 EV 71 和 Cox2 A16RNA特异性引物 ( EV 27121 /2 和 CoxA 1621 /2)对 96 例疑似 肠道病毒感染的标本进行 RT2PCR 的检测 。 Yan 等 [12 ]也使用 RT2PCR方法来检测 EV71和 CoxA 16,该法对 EV 71的敏感性 和特异性都为 100% ,对 CoxA 16 检测分别为 100%和 98. 8%。 2006年 , Chen等 [13 ]报道通过使用 EV71和 CoxA 16病毒特异性 引物进行常规多重 RT2PCR扩增并联合基因芯片技术来区分这 2种病毒 。该法首先通过 RT - PCR 扩增 EV71 和 CoxA 16 VPl 基因 ,扩增子进行荧光标记并加到点有 EV 71和 CoxA 16特异 的长为 602mer寡核苷酸探针阵列芯片上 。此方法对 EV 71 和 CoxA 16诊断的正确率分别为 92%和 96%。 3. 2 实时荧光定量 RT2PCR ( real2time fluorescent quantitative, RT2PCR) RT2PCR技术具有较高的敏感性和特异性 、不需要扩 增后处理 、有效解决 PCR 污染问题 、自动化程度高 、线性范围 宽 、重复性好 、实时监测和对模板进行定量等特点 ,已广泛应用 于病原体的快速诊断 。染料法和探针法是 RT2PCR 的 2种主要 方法 , SYBR GreenⅠ染料是 RT2PCR 法中使用比较广泛的一种 染料 ,它可以跟任何双链 DNA结合 ,因此不需要设计探针 ,适合 于任何模板的 DNA ,使用比较方便 ,且成本较低 。 TaqM an法对 目标序列具有较高的特异性 ,结果重复性也比较好 ,引物和探针 的设计相对比较简单 ,因此 ,该方法已广泛应用于临床诊断和分 子生物学研究中 。曾有使用 RT2PCR SYBR Green Ⅰ法和 Taq2 M an探针法来鉴别诊断肠道病毒和带状疱疹病毒 、单纯疱疹病 毒等病毒的报道 [14215 ] 。在这两篇文章中 ,引物和探针的设计都 是针对病毒 5’2UTR 区域的序列 ,但这个区域的序列并不能完 全和血清型相对应 ,因此该方法不能很好地区分肠道病毒血清 型 。近年来 ,也有一些关于针对 EV71VPl区域设计引物和探针 通过 RT2PCR法检测 EV 71的报道 。 Tan等 [16217 ]针对 EV71VPl 区域设计引物和探针 ,通过 RT2PCR杂交探针法和 TaqM an法特 异性检测临床样本中的 EV71。2种方法检测的敏感度可达到 5 个 EV71病毒拷贝 ,其中 TaqM an法的特异性可达到 100%。我 国也有针对 CoxA l6 特异性区域设计引物和探针 ,开发和使用 RT2PCR检测 CoxA l6的商用试剂盒 ,例如深圳太太基因工程有 限公司生产的 RT2PCR 法检测 CoxA l6试剂盒等 。除了单一管 RT2PCR检测 EV71和 CoxA16外 , Tan等 [17 ]在 2008年报道了使 用多重 RT2PCR杂交探针法检测和鉴别诊断 EV71 和 CoxA16。 在这个方法中使用了罗氏的 L ightCycler仪器及双杂交探针 ,检 测目标区域为 EV71和 CoxA l6 VP1基因的高度保守性区域 ,检
【综述 】
金玉娟 ,甘莉萍 ,陈应坚 ,杨慧 J IN Yu2juan, GAN L i2ping, CHEN Y ing2jian, YAN G Hu i
Hale Waihona Puke 摘要 肠道病毒 71型 ( Enterovirus, EV71)和柯萨奇病毒 A 组 16型 (Coxsackievirus, CoxA 16)是引起手足口病的主要病原 体 ,因此 ,快速准确地检测这 2种病原体对于手足口病治疗和控制有着至关重要的作用 。该文介绍了这 2种病原体实验室 检测技术的研究进展 ,主要包括病毒分离培养 、血清学检测 、分子生物学方法包括 RT2PCR法 、实时荧光 RT2PCR法等 。 关键词 肠道病毒 71型 ;柯萨奇病毒 A 组 16型 ;实验室检测 中国图书资料分类号 : R37312 文献标识码 : A 文章编号 : 1004 - 1257 (2009) 17 - 1878 - 03
Subject Research Progress on Laboratory Testing of Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 Authors J IN Yu2juan, GAN L i2ping, CHEN Y ing2jian, et a l1 ( L onggang D istrict Cen ter for D isease Con trol and P reven tion,
This article reviewed the current research p rogress in laboratory detection of these 2 pathogens including virus isolation, serological testing, Molecular biology methods of RT2PCR , fluorescence RT2PCR , etc. Key words Enterovirus 71; Coxsackievirus A16; Laboratory testing
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
职业与健康 2009年 9月第 25卷第 17期 Occup and Health Vol. 25 No. 17 Sep 2009
2 血清学检测方法 血清学 检 测 方 法 包 括 补 体 结 合 试 验 ( comp lement fixation
test, CF) 、中和试验与酶联免疫吸附试验 ( enzyme2linked immu2 nosorbnent assay, EL ISA ) 。中和试验中凝集 、抗原漂移以及样本 中存在多个病毒可能会阻碍抗原分型 [6 ] ,而且目前单价的 EV 71抗血清可能因存在抗原漂移而呈阴性 ,或者与 CoxA 16出现 交叉免疫反应 。补体结合抗体仅在感染期出现 ,因此 ,使用补体 结合试验可以区分既往感染和新近感染 ,但是由于该试验在不 同肠道病毒的抗原之间存在交叉反应 ,假阳性率比较高 。利用 EL ISA 捕捉法或间接法检测早期病人血清中的 IgM 和 IgG抗 体 ,是较常用的检测指标 , EL ISA法相对而言简便 、快速 、不需要 非常专业的技术人员 ,且对实验室的要求也不高 ,适合用于普通 实验 室 。但 是 有 研 究 结 果 显 示 , EL ISA 法 的 敏 感 性 低 于 PCR 法 [5 ] 。
手足口病 ( hand, foot and mouth disease, HFMD )是由肠道病 毒 ( Enterovirus, EV )引起的一种全球性急性传染病 ,常见于学龄 前儿童 ,尤以婴幼儿多见 。自 1957年新西兰首次报道以来 ,世 界大部分地区都有该病流行的报道 。2006年 ,世界卫生组织公 布该病在须申报疾病 (法定传染病 )中的发病率位居第 4 位 。 我国自 2008年 3月份以来 ,也在多个省份大规模地暴发了手足 口病 ,并出现了死亡病例报道 ,因此 ,我国卫生部于 2008年 5月 2日起 ,也将其列为丙类传染病 [1 ] 。引起手足口病的病原体多 种多样 ,但均为单股正链 RNA病毒 ,小 RNA 病毒科 ,肠病毒属 , 包括肠道病毒 71型 ( EV 71 )利柯萨奇病毒 A 组 4、5、9、10、16 型以及 B组 2和 5型等肠道病毒 ,其主要病原体是 EV 71和柯 萨奇病毒 A 组 16型 (CoxA 16) [223 ] 。 EV 71感染的临床症状在 不同地区 、不同时间表现也不尽相同 ,而且部分重症病例临床上 并无典型的手足口病表现 ,所以 ,在疫情暴发初期 ,重症病例常 常难以明确诊断 ,常被诊断为肺炎 ,加上目前尚无十分安全有效 的疫苗和特效药 ,因此对这 2种病原体及时快速的检测对于手 足口病的治疗和控制有着至关重要的作用 。但在通常情况下 , EV 71和 CoxA 16所致的手足口病临床上难以区别 ,与 CoxA 16 相比 , EV 71能引起更严重的中枢神经相关的疾病 ,病死率高 , 死亡速度快 ,而且 EV 71和 CoxA 16在遗传学上同源性也较高 , 核苷酸有 77%的同源性 ,氨基酸的同源性为 89% [2 ] 。因此 ,发 展快速 、准确 、特异的对 EV 71 和 CoxA 16 的诊断方法尤为重 要 。笔者就近年来对这 2种病毒实验室检测技术方面的研究进 展进行综述 。
职业与健康 2009年 9月第 25卷第 17期 Occup and Health Vol. 25 No. 17 Sep 2009
肠道病毒 71型和柯萨奇病毒 A组 16型 实验室检测研究进展
Current Progress in M ethods for Laboratory Detection of Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16
1879
和 CoxA 16病毒特异性核苷酸设计不同的引物 ,进行 RT2PCR 反应 ,对 EV 71和 CoxA 16病毒进行检测和鉴别诊断 ,己成为公 共卫生实验室快速诊断 EV 71和 CoxA 16流行及其分子流行病 学特征的重要手段 。
EV 71和 CoxA16VPl基因具有与病毒血清型完全对应的遗 传多样性 ,其基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分 类的依据 ,并可作为小 RNA 病毒科内不同属的分类参考 [728 ] ,肠 道病毒的 5’端非编码区 (5’2UTR)的属特异性可以区分肠道病 毒与其他小 RNA病毒 ,与血清型也有一定的相关性 ,因此 ,近年 来 EV 71 和 CoxA 16 引物设计主要针对 VPl和 5’2UTR 区域 。 例如 Shinohara等 [9 ]曾报道 ,通过 3 个步骤鉴别 EV7 1 和 CoxA 16,病毒分离后 ,使用引物 Primer 2 / E 33进行 RT2PCR 扩增 ,最 后使用限制性内切酶 TaqⅠ和 EcoT 22Ⅰ进行酶切 , EV 71产物 不能被酶切而 CoxA 16产物均能酶切 ,从而达到检测和鉴别这 2 种病毒的目的 。 Sinch等 [10 ]基于 EV 71的 VP1区域设计了一对 引物 ( VP1F2 和 VPlR2 ) , 杨 洪 等 [11 ] 使 用 两 对 EV 71 和 Cox2 A16RNA特异性引物 ( EV 27121 /2 和 CoxA 1621 /2)对 96 例疑似 肠道病毒感染的标本进行 RT2PCR 的检测 。 Yan 等 [12 ]也使用 RT2PCR方法来检测 EV71和 CoxA 16,该法对 EV 71的敏感性 和特异性都为 100% ,对 CoxA 16 检测分别为 100%和 98. 8%。 2006年 , Chen等 [13 ]报道通过使用 EV71和 CoxA 16病毒特异性 引物进行常规多重 RT2PCR扩增并联合基因芯片技术来区分这 2种病毒 。该法首先通过 RT - PCR 扩增 EV71 和 CoxA 16 VPl 基因 ,扩增子进行荧光标记并加到点有 EV 71和 CoxA 16特异 的长为 602mer寡核苷酸探针阵列芯片上 。此方法对 EV 71 和 CoxA 16诊断的正确率分别为 92%和 96%。 3. 2 实时荧光定量 RT2PCR ( real2time fluorescent quantitative, RT2PCR) RT2PCR技术具有较高的敏感性和特异性 、不需要扩 增后处理 、有效解决 PCR 污染问题 、自动化程度高 、线性范围 宽 、重复性好 、实时监测和对模板进行定量等特点 ,已广泛应用 于病原体的快速诊断 。染料法和探针法是 RT2PCR 的 2种主要 方法 , SYBR GreenⅠ染料是 RT2PCR 法中使用比较广泛的一种 染料 ,它可以跟任何双链 DNA结合 ,因此不需要设计探针 ,适合 于任何模板的 DNA ,使用比较方便 ,且成本较低 。 TaqM an法对 目标序列具有较高的特异性 ,结果重复性也比较好 ,引物和探针 的设计相对比较简单 ,因此 ,该方法已广泛应用于临床诊断和分 子生物学研究中 。曾有使用 RT2PCR SYBR Green Ⅰ法和 Taq2 M an探针法来鉴别诊断肠道病毒和带状疱疹病毒 、单纯疱疹病 毒等病毒的报道 [14215 ] 。在这两篇文章中 ,引物和探针的设计都 是针对病毒 5’2UTR 区域的序列 ,但这个区域的序列并不能完 全和血清型相对应 ,因此该方法不能很好地区分肠道病毒血清 型 。近年来 ,也有一些关于针对 EV71VPl区域设计引物和探针 通过 RT2PCR法检测 EV 71的报道 。 Tan等 [16217 ]针对 EV71VPl 区域设计引物和探针 ,通过 RT2PCR杂交探针法和 TaqM an法特 异性检测临床样本中的 EV71。2种方法检测的敏感度可达到 5 个 EV71病毒拷贝 ,其中 TaqM an法的特异性可达到 100%。我 国也有针对 CoxA l6 特异性区域设计引物和探针 ,开发和使用 RT2PCR检测 CoxA l6的商用试剂盒 ,例如深圳太太基因工程有 限公司生产的 RT2PCR 法检测 CoxA l6试剂盒等 。除了单一管 RT2PCR检测 EV71和 CoxA16外 , Tan等 [17 ]在 2008年报道了使 用多重 RT2PCR杂交探针法检测和鉴别诊断 EV71 和 CoxA16。 在这个方法中使用了罗氏的 L ightCycler仪器及双杂交探针 ,检 测目标区域为 EV71和 CoxA l6 VP1基因的高度保守性区域 ,检
【综述 】
金玉娟 ,甘莉萍 ,陈应坚 ,杨慧 J IN Yu2juan, GAN L i2ping, CHEN Y ing2jian, YAN G Hu i
Hale Waihona Puke 摘要 肠道病毒 71型 ( Enterovirus, EV71)和柯萨奇病毒 A 组 16型 (Coxsackievirus, CoxA 16)是引起手足口病的主要病原 体 ,因此 ,快速准确地检测这 2种病原体对于手足口病治疗和控制有着至关重要的作用 。该文介绍了这 2种病原体实验室 检测技术的研究进展 ,主要包括病毒分离培养 、血清学检测 、分子生物学方法包括 RT2PCR法 、实时荧光 RT2PCR法等 。 关键词 肠道病毒 71型 ;柯萨奇病毒 A 组 16型 ;实验室检测 中国图书资料分类号 : R37312 文献标识码 : A 文章编号 : 1004 - 1257 (2009) 17 - 1878 - 03
Subject Research Progress on Laboratory Testing of Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 Authors J IN Yu2juan, GAN L i2ping, CHEN Y ing2jian, et a l1 ( L onggang D istrict Cen ter for D isease Con trol and P reven tion,
This article reviewed the current research p rogress in laboratory detection of these 2 pathogens including virus isolation, serological testing, Molecular biology methods of RT2PCR , fluorescence RT2PCR , etc. Key words Enterovirus 71; Coxsackievirus A16; Laboratory testing
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
职业与健康 2009年 9月第 25卷第 17期 Occup and Health Vol. 25 No. 17 Sep 2009
2 血清学检测方法 血清学 检 测 方 法 包 括 补 体 结 合 试 验 ( comp lement fixation
test, CF) 、中和试验与酶联免疫吸附试验 ( enzyme2linked immu2 nosorbnent assay, EL ISA ) 。中和试验中凝集 、抗原漂移以及样本 中存在多个病毒可能会阻碍抗原分型 [6 ] ,而且目前单价的 EV 71抗血清可能因存在抗原漂移而呈阴性 ,或者与 CoxA 16出现 交叉免疫反应 。补体结合抗体仅在感染期出现 ,因此 ,使用补体 结合试验可以区分既往感染和新近感染 ,但是由于该试验在不 同肠道病毒的抗原之间存在交叉反应 ,假阳性率比较高 。利用 EL ISA 捕捉法或间接法检测早期病人血清中的 IgM 和 IgG抗 体 ,是较常用的检测指标 , EL ISA法相对而言简便 、快速 、不需要 非常专业的技术人员 ,且对实验室的要求也不高 ,适合用于普通 实验 室 。但 是 有 研 究 结 果 显 示 , EL ISA 法 的 敏 感 性 低 于 PCR 法 [5 ] 。
手足口病 ( hand, foot and mouth disease, HFMD )是由肠道病 毒 ( Enterovirus, EV )引起的一种全球性急性传染病 ,常见于学龄 前儿童 ,尤以婴幼儿多见 。自 1957年新西兰首次报道以来 ,世 界大部分地区都有该病流行的报道 。2006年 ,世界卫生组织公 布该病在须申报疾病 (法定传染病 )中的发病率位居第 4 位 。 我国自 2008年 3月份以来 ,也在多个省份大规模地暴发了手足 口病 ,并出现了死亡病例报道 ,因此 ,我国卫生部于 2008年 5月 2日起 ,也将其列为丙类传染病 [1 ] 。引起手足口病的病原体多 种多样 ,但均为单股正链 RNA病毒 ,小 RNA 病毒科 ,肠病毒属 , 包括肠道病毒 71型 ( EV 71 )利柯萨奇病毒 A 组 4、5、9、10、16 型以及 B组 2和 5型等肠道病毒 ,其主要病原体是 EV 71和柯 萨奇病毒 A 组 16型 (CoxA 16) [223 ] 。 EV 71感染的临床症状在 不同地区 、不同时间表现也不尽相同 ,而且部分重症病例临床上 并无典型的手足口病表现 ,所以 ,在疫情暴发初期 ,重症病例常 常难以明确诊断 ,常被诊断为肺炎 ,加上目前尚无十分安全有效 的疫苗和特效药 ,因此对这 2种病原体及时快速的检测对于手 足口病的治疗和控制有着至关重要的作用 。但在通常情况下 , EV 71和 CoxA 16所致的手足口病临床上难以区别 ,与 CoxA 16 相比 , EV 71能引起更严重的中枢神经相关的疾病 ,病死率高 , 死亡速度快 ,而且 EV 71和 CoxA 16在遗传学上同源性也较高 , 核苷酸有 77%的同源性 ,氨基酸的同源性为 89% [2 ] 。因此 ,发 展快速 、准确 、特异的对 EV 71 和 CoxA 16 的诊断方法尤为重 要 。笔者就近年来对这 2种病毒实验室检测技术方面的研究进 展进行综述 。
