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RT-qPCR比较不同样本中miR-21的相对表达差异
一、实验目的
1、掌握实时荧光定量PCR的实验原理。
2、掌握实时荧光定量PCR相对定量的分析方法。
二、实验原理
实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。荧光定量PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR Green Ⅰ的非特异性方法和 Taqman 水解探针的特异性方法。本实验中采用非特异性 SYBR Green I 染料法，SYBR Green I 是一种结合于所有 ds DNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下会发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强。因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
三、实验仪器、材料和试剂
实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪
实验材料：MCF7细胞
实验试剂：逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒
四、实验步骤
MCF7细胞RNA提取（RNAiso Plus）
1)将生长至80%的MCF细胞消化为单细胞悬液，准备提取RNA；
2)9000g,2min离心，弃掉培养基，加1 ml RNAiso Plus用移液枪反复吹吸直
至裂解液中无明显沉淀，室温（15-30℃）静置5分钟；
3)加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈
乳白色，室温静置5min；
4)12,000 g 4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为
三层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相。
5)吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。
6)向上清中加入倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，
室温下静置10分钟。
7)12,000g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。
8)弃上清，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管
底，让沉淀浮起来，并静置3-5 min；
9)打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量(可以根据沉
淀的多少确定）的RNase-free 水溶解沉淀。测浓度，记录A260/280。
1%琼脂糖凝胶电泳（取少部分进行跑电泳，留足够的量做反转录）
反转录
试剂体积（10μl）
RNA500 ng
1μl
Gene specific primers(2μM）RT
primer
2μl
5×ReverseTranscriptase M-MLV
Buffer
dNTP (10mM)μl
Reverse Transcriptase M-MLVμl
Inhibitor (40 U/μl)μl
RNase-Free Water Up to 10μl
反应条件：
温度：42℃，45min;70℃，15min.
qPCR
试剂体积（20μl）
2×SYBR Green10μl
FP (10μl)μl
RP(10μl)μl
cDNA Template1μl
RNase-free Water8μl
反应程序：
1）stage 1：预变性，95℃，3min;
2）Stage 2:循环反应：40个循环
95℃，10s;
60℃，30s
3）溶解曲线：95 ℃，15 s；60℃，1 min；95 ℃，15 s.
五．实验结果及分析
RNA的质量检测结果
扩增曲线：
溶解曲线：
如图，为单一的峰，说明无非特异性产物，定量准确。
实验结果及数据处理
PCR 反应结束后，得到如下数据：
注：平行样的 Ct 值之间的差< 时表示重复性较好
计算如下：
ΔCT(miR21)=
ΔCT(miR130b)=
ΔΔCT= ΔCT(miR21)- ΔCT(miR130b)
=
miR21的表达量是miR130b的倍
六．问题与思考
1.设计本次实验miR-21和miR-130b的RT-qPCR引物？
miR21: TAGCTTATCAGACTGATGTTGA
茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA
F Primer: AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTG
R Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC（通用引物）
引物Blast 结果：
miR130b：CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT
茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCCC
F Primer: CAGTGCAATGATGAAAGGGCA
R Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC（通用引物）
引物Blast 结果：
2.荧光定量PCR与普通PCR有什么异同点？
原理不同：荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光；普通PCR 通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR最终产物量，一般是紫外光。
反应要求不同：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小，荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析，普通PCR必须电泳。
结果不同：荧光定量可以实现精确定量，普通PCR则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率，溶解温度，直接得到的标准曲线等，这些是普通PCR无法实现的。
