柠檬苦素类似物及其D环内酯酶研究进展

利莫宁在 LPS刺激的 BV2微胶质细胞炎症过程中作用研究摘要：鉴于近些年来神经性退行性疾病的病发率越来越高的现象，医学界对该类疾病的研究也在不断深入。

从医学角度上来看，炎症是一种保护反应，以确保稳态，它针对有毒物质，对抗病原体和防止组织损伤从而有利于组织修复。

相反，不受控制的炎症会导致过度的细胞和组织损伤，通过激活细胞死亡来破坏正常组织。

线粒体过量产生ROS和过度产生细胞因子通常被认为是脑损伤、炎症和退行性疾病的发病机制。

导致对患者正常组织带来负面影响。

从现行研究结果来看，利莫宁以其优异的治疗价值广受人们的关注，其药理价值相对比较复杂，本文研究即针对该药物对患者的作用机理进行深入研究，为神经性退行性疾病的治疗提供参考。

关键词：神经性退行性疾病；细胞脑组织；药理价值；利莫宁引言中枢神经系统(CNS)包括神经元、内皮细胞、星形胶质细胞和胶质细胞。

活化的胶质细胞，即小胶质细胞和星形胶质细胞通过激活炎症途径在神经变性的发病机制中起着至关重要的作用。

胶质瘤是一种以星形细胞增生、细胞体肥大为特征的炎症状态。

当用脂多糖(LPS)等毒素刺激时，胶质细胞产生白介素(IL)1β和肿瘤坏死因子TNF-α，导致炎症发病。

在创伤、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)等疾病中，活化的小胶质细胞产生炎症介质，如环加氧酶(COX-2)/前列腺素(PGS)、iNOS/一氧化氮(NO)或细胞因子以及神经毒性物质，介导脑组织损伤。

此外，越来越多的证据还表明，炎症促进不同的脑疾病，显然通过激活胶质细胞和炎症途径杀死神经元。

因此，本研究的重点是旨在激活胶质细胞和相关炎症途径和/或介质的策略或方法，可能有助于临床管理炎症相关神经退行性疾病[1]。

一、研究整体概述柠檬苦素是一种柠檬酸盐(柠檬酸盐D-环内酯和柠檬酸二-δ内酯)，存在于柑橘植物的叶片、果实和根茎中，化学性质为呋喃内酯。

据报道，大约有300个柠檬素类似物已从自然资源中分离出来。

香兰素生物合成的研究进展一、本文概述香兰素，也称为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，是一种重要的有机化合物，具有独特的香气和广泛的应用价值。

作为一种天然香料，香兰素在食品、化妆品和烟草等行业中有着广泛的应用。

香兰素也是合成许多重要化合物的中间体，如药物、染料和农药等。

因此，香兰素的生物合成研究一直备受关注。

本文旨在综述近年来香兰素生物合成的研究进展，重点关注生物合成途径、关键酶和基因工程等方面的研究。

通过对相关文献的梳理和分析，本文总结了香兰素生物合成的不同途径，包括莽草酸途径、苯丙氨酸途径和酪氨酸途径等，并深入探讨了各途径中的关键酶及其催化机制。

本文还介绍了利用基因工程技术在微生物中构建香兰素生物合成途径的研究进展，为香兰素的工业化生产提供了新的思路和方法。

通过对香兰素生物合成研究的综述，本文旨在为相关领域的研究人员提供全面的信息和参考，推动香兰素生物合成技术的进一步发展和应用。

本文也期望能够引起更多学者对香兰素生物合成的关注和研究，共同推动该领域的发展。

二、香兰素生物合成的途径香兰素，又称香草醛，是一种重要的香料和有机合成中间体，广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。

近年来，随着生物技术的快速发展，香兰素的生物合成途径逐渐成为研究热点。

传统的香兰素合成方法主要依赖于化学合成，但这种方法存在环境污染、能源消耗大等问题。

相比之下，生物合成途径具有环保、可持续等优势，因此备受关注。

目前，香兰素的生物合成途径主要包括两条：一是通过植物提取，二是通过微生物发酵。

植物提取法主要利用香草等植物的提取物，经过提取、分离、纯化等步骤得到香兰素。

这种方法虽然环保，但提取效率较低，成本较高。

微生物发酵法则是利用特定的微生物菌株，通过发酵过程产生香兰素。

这种方法具有原料来源广泛、生产效率高、成本低等优势。

目前，已经有一些微生物菌株被报道能够产生香兰素，如某些真菌和细菌。

这些菌株通过代谢途径中的一系列酶催化反应，将简单的碳源和氮源转化为香兰素。

1、苦味产生的机理2、目前掩味技术的发展3、恩诺沙星、替米考星掩味4、氟喹诺酮类掩味相关和其他味觉一样，苦味是由含有化学物质的液体刺激引起的感觉。

味觉的感受器是味蕾，味蕾呈卵圆形，主要由味细胞和支持细胞组成，味细胞顶部有微绒毛向味孔方向伸展，与唾液接触，细胞基部有神经纤维支配。

味觉的形成机理是：分布于味蕾中味细胞顶部微绒毛上的苦味受体蛋白与溶解在液相中的苦味质结合后活化，经过细胞内信号转导，使味觉细胞膜去极化，继而引发神经细胞突触后兴奋，兴奋性信号沿面神经、舌咽神经或迷走神经进入延髓孤束核，更换神经元到丘脑，最后投射到大脑中央后回最下部的味觉中枢，经过神经中枢的整合最终产生苦味感知。

人有酸、甜、苦、咸4种基本味觉，分别由不同刺激引起。

4种基本味觉与其他传入冲动如触觉、嗅觉、温觉等在中枢综合也可形成其他味觉如香、辣、涩等。

目前，苦味掩味技术主要是用各种化学物质针对味觉形成的不同环节进行干预。

存在于食物和药物中的苦味物质基本上都是天然存在的成分生物碱、萜类、糖苷类和苦味肽类胆汁、某些氨基酸含氮有机物及某些无机盐类-NO2、=N、=N-、-SH、-S-、SO2H、-S-S、=C=S2.1加入矫味剂使味蕾产生错觉2.2避免苦味药物与味蕾的直接接触2.3可逆和暂时地麻痹味蕾2.4通过与药物竞争苦味受体或阻断向大脑发送苦味信号11、甜味剂，如蔗糖、甜菊苷等麻痹或让味蕾产生错觉。

主要针对较弱的苦味或不良味感芳香剂胶浆剂苦味遮盖剂矫味增强剂包衣法是固体制剂氢化油和表面活性剂将有机酸如柠檬酸或酒石酸与碳酸氢盐混合，加适量辅料制成。

遇水后会产目前仅限于实验室研究。

嵌入环糊精分子内部这种方法载药量低,只适合于低剂量药物特别适合于多组分的中药复方制剂。

熔融法低熔点辅料可能会阻滞药物的溶出喷雾冷凝法制粒很有效的方法滴制法热稳定的药物腺苷酸(AMP)适用于苦味强度依赖于溶解度的药物脂质体有一定难度苦味药物与非离子表面活性剂结合，形成疏水的复合物恩诺沙星棕榈酸盐2、恩诺沙星微囊物以物理方法有效掩盖恩诺沙星的苦味必须阻止恩诺沙星在动物口腔中释放. 目前报道主要是以微囊或微球包被阻止药物释放，由于恩诺沙星苦味值极低，已有的制剂矫味效果往往较差，且生产要求较高。

不同贮藏条件对沙田柚果实苦味物质含量的影响刘萍;黄春霞;邓光宙;范七君;牛英【摘要】The “Shatian” Pomelo (Citrus grandis Osbeck) was native to Guangxi, rich in nutrition and for hyperten-sion and diabetes patients to eat. In recent years, there were many problems in the industry, such as quality de-creased, smell and bitter generated. The “Shatian” Pomelo were stored under ambient temperature with film (A), ambient temperature without film (B) and 4 ℃ without film (C). Naringin, limonin and nomilin contents in different sues of fruits were determined during storage by high-performance liquid chromatography. The results showed that Nar-ingin as main bittering substance of Shatian” Pomelo was distributed in the albedos and segment membranes. Li-monoids mainly distributed in the seeds and flavedos, and nomilin mainly distributed in the seeds. Changes of bittering substance contents were different during storage under three storage conditions. The naringin content slightly increased during storage, while limonin and nomilin contents declined overall with a minor fluctuation. The contents of limonin and nomilin in juice sac increased firstly and then decreased. On the 30th day of storage, A, B and C storage condi-tions of naringin contents in juice sacs were (0.139 ± 0.006), (0.190 ± 0.009) and (0.194 ± 0.019) mg•g-1 re-spectively and limonin contents were (47.28 ± 1.91), (33.64 ± 1.90) and (84.19 ± 5.56) μg•g-1 respectively. Comparing with the A and B storage conditions, the contents of naringin and limonin of fruit juice sac under 4 ℃ lowtemperature storage (C storage conditions) were the highest. On the contrary, the contents of naringin, limonin and nomilin in flavedos, albedos, segment membranes and seeds were the lowest under C storage condition. This study pro-vides theoretical guides for storage of postharvest “Shatian” Pomelo.%沙田柚原产广西,营养丰富且适合高血压和糖尿病等患者食用,近年来在沙田柚产业中存在品质下降、有苦味、异味生成等问题。

湖南大学农学院2022年《食品化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 脂肪氧化与水分活度的关系是：水分活度越高，脂肪氧化速度越快；水分活度越低，脂肪氧化速度越慢。

（）答案：错误解析：2. 麦拉德反应早期加入亚硫酸可防止氨基酸营养价值损失。

（）[华中农业大学2018研]答案：错误解析：3. 蔗糖液的黏度随温度升高而增大，葡萄糖液则相反。

（）[昆明理工大学2018研]解析：葡萄糖溶液的黏度随温度升高而增大，蔗糖溶液的摩擦系数则随温度增大公差而降低。

4. DNA分子的熔点（Tm）值随着（A＋T）含量的增加而降低。

（）[扬州大学2017研]答案：正确解析：DNA分子的熔点是指在加热条件下使DNA变性默氏的温度范围的中点温度。

计算经验式为Tm＝69.3＋0.41（G＋C），若（A＋T）含量增加，则（G＋C）会相应减少，导致熔点降低。

5. 糖的甜度与糖的构型无关。

（）答案：错误解析：6. 脂肪氧化与水分活度的关系是：水活度越低，氧化速度越慢。

（）答案：错误解析：7. 煮马蹄时加入小苏打会使马蹄颜色变黄。

（）[华中农业大学2018研]解析：马蹄中含有丰富的淀粉，在煮马蹄截叶的过程中所加入小苏打，小苏打分解成碳酸钠，呈碱性，在加热的条件下会使淀粉糊化变黄。

8. 美拉德反应与焦糖化反应的不同在于温度不同，焦糖化反应的温度更高。

（）[浙江大学2018、2019研]答案：错误解析：美拉德反应与焦糖化反应的不同不仅仅是温度，它们的发生条件不同：美拉德反应是羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）间的反应，焦糖化反应是糖类尤其是单糖在没有氨基化合物存在的情况下，加热到熔点以上的高温（一般是140～170℃以上）时，因糖发生脱水与降解而产生。

DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025667引用格式:卢剑青,周明,蔡志鹏,等.采收期㊁贮藏时间及加工单元操作对赣南脐橙汁苦味物质含量的影响[J].食品与发酵工业,2021,47(6):105-113.LU Jianqing,ZHOU Ming,CAI Zhipeng,et al.Effects of harvest time,storage time and processing u-nit operation on bitter substance of Gannan navel orange juice[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(6):105-113.采收期㊁贮藏时间及加工单元操作对赣南脐橙汁苦味物质含量的影响卢剑青1,周明2,蔡志鹏1,王静1,朱丽琴1,李晓明1,罗运梅3,陈金印4,沈勇根1∗1(江西农业大学食品科学与工程学院,江西省发展与改革委员会农产品加工与安全控制工程实验室,江西南昌,330045)2(江中食疗科技有限公司,江西九江,332020)3(华南农业大学食品学院,广东广州,510630)4(江西农业大学农学院,江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室,江西南昌,330045)摘㊀要㊀探讨赣南脐橙采收期㊁贮藏时间及加工单元操作对橙汁苦味物质(柠檬苦素㊁诺米林)含量的影响,为降低橙汁苦味提供参考㊂测定不同采收期与贮藏时间及不同加工单元操作下的橙汁中的苦味物质含量,重点研究橙汁热处理过程中苦味物质的变化并进行动力学模型拟合㊂结果表明,随着采收期的延长,橙汁中柠檬苦素与诺米林的含量逐渐降低,但在贮藏期间,橙汁中的柠檬苦素与诺米林含量先升高后降低;破碎汁中柠檬苦素与诺米林含量均高于挤压汁,酶解工艺后破碎汁和挤压汁中柠檬苦素含量均大幅升高,而诺米林未被检出;热处理温度越高㊁pH 值越低,橙汁中苦味物质含量越高,当pH 值>6.0时,柠檬苦素和诺米林均未在橙汁中检出,同时可用联合反应模型拟合热处理过程中橙汁柠檬苦素和诺米林含量变化㊂脐橙采收期与贮藏期和加工单元操作特别是热处理条件均对橙汁苦味物质的含量影响较大,后续可通过延迟采收期与贮藏时间㊁优化取汁方法及控制热处理参数等措施降低橙汁的苦味物质含量㊂关键词㊀橙汁;柠檬苦素;诺米林;加工与贮藏;热处理第一作者:卢剑青(硕士研究生)和周明(硕士研究生)为共同第一作者(沈勇根教授为通讯作者,E-mail:137898404@)㊀㊀基金项目:江西省现代农业产业技术体系(柑橘)建设专项项目(JXARS-07)收稿日期:2020-09-15,改回日期:2020-10-14㊀㊀脐橙,芸香科柑橘属橙类[1],富含V C ㊁糖㊁有机酸㊁类黄酮㊁类柠檬苦素等营养物质,对调节人体代谢㊁维持机体健康大有裨益,深受广大消费者的喜爱[2-3]㊂赣南脐橙是我国脐橙的知名品牌,获得国内外专家学者的一致称誉,但其约90%都用于鲜食,深加工产品不足[4]㊂果汁作为脐橙的主要加工产品之一,能够极大程度地利用脐橙资源,然而脐橙在制汁后产生的 后苦味 ,是一直制约着脐橙进行加工的主要因素,同时也影响着我国柑橘产业的进一步发展㊂前人研究表明,柠檬苦素和诺米林是造成橙汁加工过程中出现 后苦味 的主要物质,而柠檬苦素在果实中主要以柠檬苦素-A-环内酯(limonin A-ring lactone,LARL)的形式存在,榨汁时从果实中溶出,逐渐转变成柠檬苦素等苦味物质,且该转变过程在酸性或热处理条件下表现的更明显[5-7]㊂虽然柠檬苦素有促进人体代谢㊁抗氧化㊁消炎镇痛㊁抗癌潜力等诸多益处[8-11],但因其在果汁中苦味阈值较低,严重影响了果汁的口感㊂柠檬苦素在果汁中的苦味阈值约为3.4mg /L,其苦味程度比柚皮苷的苦味高约20倍[12-13]㊂毕静莹[14]研究显示,在纯净水中诺米林的识别阈值是柠檬苦素的1.29倍,但是在模拟柑橘汁中柠檬苦素和诺米林的苦味识别阈值分别约为4.67mg /L 和4.61mg /L㊂针对橙汁加工的 后苦味 脱除问题,学者们进行了大量研究,提出了吸附脱苦㊁膜分离脱苦㊁酶法脱苦㊁固定细胞法等多种脱苦工艺,各种方法的脱苦效率不一,然而将其扩大至工业化使用仍然有一定的缺陷[13,15-17]㊂国内外大量研究指出,脐橙果实在成熟过程中,柠檬苦素前体是逐渐降低的[18],但对于赣南脐橙普遍的采收期内以及果实在贮藏过程中,其制备橙汁中的苦味物质含量变化未见相关报道㊂同时因普遍研究认为柠檬苦素是橙汁中主要的 后苦味 物质,针对诺米林在加工过程中含量变化的研究较少㊂虽然橙汁中诺米林含量比柠檬苦素低很多,但DEA 等[19]指出,柠檬苦素和诺米林的协同作用会使2种苦味物质的阈值均降低,仅为柠檬苦素浓度一半的诺米林会增加橙汁的苦感㊂本研究采用高效液相色谱分析法,系统地研究了脐橙果实采收㊁贮藏及加工单元操作对橙汁中柠檬苦素和诺米林含量的影响,并深入研究热处理温度和pH 值对橙汁中苦味物质含量的影响,以期得出脐橙加工较适宜的采收与贮藏期,并为寻求新的脱苦途径提供思路㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂1.1.1㊀试验材料脐橙于2018年11月13日采自江西省宁都县,品系为纽荷尔脐橙,采样时选择长势㊁高度均一的果树,选取果径接近的果实作为试验样品㊂1.1.2㊀主要试剂乙腈(色谱纯),美国天地有限公司;二氯甲烷(分析纯),西陇科学股份有限公司;柠檬苦素(纯度ȡ98%),北京索莱宝科技有限公司;诺米林标准品(纯度ȡ98%),上海源叶生物科技有限公司;柠檬酸(食品级),河南万邦实业有限公司;NaHCO3(食品级),潍坊绿鑫经贸有限公司㊂1.2㊀仪器与设备Aglient1260型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司;JNO26675型低速离心机,上海安寿科学仪器厂;BSA124S型电子分析天平,北京赛多利斯科学仪器有限公司;SB3200DTDN型超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;QL-901涡旋混合器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;RE-52AA旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;MJ-PB40E253C加热破壁营养料理机,广东美的生活电器制造有限公司; SPY-60实验型高压均质机,上海顺仪实验设备有限公司;JM140胶体磨-立式,温州市胶体磨厂㊂1.3㊀试验方法1.3.1㊀脐橙采收与贮藏期样品处理脐橙果实采收和贮藏试验均以10d为1个周期,果实贮藏温度为4ħ㊂在每个试验周期,分别测定取汁后不作任何处理的橙汁和取汁后在70ħ热处理30min后的橙汁中柠檬苦素和诺米林的含量㊂1.3.2㊀模拟橙汁加工关键单元操作挑选完整㊁良好,大小和色泽均一的赣南脐橙果实去皮,榨汁后混合均匀,加工单元对果汁影响试验分别采用挤压和破碎的方式取汁,分为2条加工工艺,即挤压(或破碎)ң过滤(200目)ң酶解澄清(800mg/L果胶酶45ħ保持4h后过滤)ң胶体磨(胶体磨处理5 min)ң均质(均质2次,前后2次均质压力分别为35和40MPa)ң浓缩(可溶性固形物减压浓缩至55%后复原至原果汁含量,下文统称浓缩)㊂1.3.3㊀不同温度和pH对橙汁热处理热处理条件对果汁品质影响试验统一采用压榨的方式取汁:(1)将混匀后果汁分别等量取10mL分装于离心管中,分别在50,60,70,80,90,100ħ下热处理5~30min(每个温度间隔5min取1次样);(2)将原果汁分别用柠檬酸和NaHCO3调果汁pH值为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0㊂在70ħ条件下热处理5~ 30min(每个温度间隔5min取1次样)㊂1.3.4㊀苦味物质含量测定参考陈静等[20]和李一兵等[21]的方法利用超声波辅助提取橙汁中的柠檬苦素和诺米林,改进后方法如下:使用二氯甲烷作为萃取剂,将待提取橙汁和二氯甲烷以体积比1ʒ1(该试验橙汁和二氯甲烷均取10mL)加入50ml带盖离心管中,涡旋振荡后,室温下160W功率超声提取40min,后于3000r/min的转速离心10min,分离出下层清液,剩余成分再加入二氯甲烷提取1次,步骤同第1次㊂将2次得到的下层清液合并,使用旋转蒸发仪以60ħ蒸干后,加入1.5mL乙腈溶解,并过0.22μm有机滤膜,置于HPLC进样瓶中待测㊂使用HPLC同时检测柠檬苦素和诺米林进行检测,该试验设定参数如下:检测波长210nm;进样量10μL;柱温30ħ;流动相为乙腈和超纯水,V(乙腈)ʒV(超纯水)=11ʒ9,以流速1mL/min等度洗脱20min㊂1.3.5㊀动力学模型拟合分析通过观察苦味物质随温度㊁时间变化的趋势,并参照阮卫红等[22]的方法,采用零级㊁一级动力学和联合反应动力学模型进行拟合,分别如公式(1)㊁公式(2)㊁公式(3)所示:C=C0+k0t(1)C=C0e(k1t)(2)C=k0/k1-(k0/k1-C0)e(-k1t)(3)式中:C为任意时间指标的测定值;C0为该指标的起始值;t表示时间,min;k0㊁k1分别表示零级动力学和一级动力学的反应常数㊂1.3.6㊀统计与分析实验过程中分别对每个处理组进行3次重复,试验数据采用Excel2016和Origin9.1以及SPSS22.0进行统计分析㊂各项指标以平均数ʃ标准差表示,P< 0.05为差异显著㊂2㊀结果与分析2.1㊀不同采收期脐橙制备的橙汁中柠苦素及诺米林含量的变化因预实验显示热处理会大幅提高橙汁中柠檬苦素和诺米林的含量,故对每个采收期的脐橙制备的橙汁,分别测定其未热处理与热处理后的柠檬苦素和诺米林含量㊂如图1所示,在整个试验期内热处理橙汁中的柠檬苦素和诺米林含量均表现出显著降低的趋势(P<0.05),12月23日相比于11月13日,热处理橙汁中柠檬苦素和诺米林含量分别降低了47.57%㊁75.15%㊂橙汁中诺米林含量相比柠檬苦素更低,且未热处理橙汁在12月23日时的诺米林未被检出,不同的是,未热处理橙汁中的柠檬苦素在11月23日后均无显著差异(P>0.05)㊂WU等[23]研究柑橘成熟过程中以及朱春华等[24]研究柠檬果实生长过程中柠檬苦素的变化趋势,与本试验相吻合㊂脱乙酰诺米林酸和诺米林是柑橘中柠檬苦素的前体物质,其在茎的韧皮部进行合成,在生长过程中向植物的叶㊁果实㊁种子等组织中转移,并且在种子和果实中通过代谢等方式逐渐转化为LARL 等类柠檬苦素化合物㊂随着果实成熟度的增加,绝大部分类柠檬苦素苷元会逐渐转化为无苦味的类柠檬苦素糖苷(limonoids glucoside,LG),即LARL的葡萄糖共氧化形成柠檬苦素17-β-D-吡喃葡萄糖苷等,但是柠檬苦素类化合物总量(LARL+LG)积累至一定水平后趋于稳定,这是一个自然的去苦味过程[16,25-26]㊂在该试验中,延长脐橙的采收时间,使更多的类柠檬苦素苷元继续转化成糖苷,从加工的源头降低橙汁中柠檬苦素和诺米林的含量㊂JUNGSAKULRUJIREK等[27]研究指出,延长采收时间对于柑橘汁胞中产生柠檬苦素的含量无显著影响,但种子㊁果皮和囊衣中产生的柠檬苦素含量显著降低㊂在脐橙取汁过程中,果皮和囊衣中产生的柠檬苦素会溶出至橙汁中,因此加工过程中的取汁方法对橙汁中苦味物质含量起决定性作用㊂2.2㊀不同贮藏期脐橙制备的橙汁中柠檬苦素及诺米林含量的变化如图2所示,脐橙贮藏过程中,未加热和加热处理的橙汁中柠檬苦素含量变化趋势类似,均表现出先升高后降低的趋势㊂在贮藏第20天时,柠檬苦素含量达到最高,未加热橙汁柠檬苦素含量为5.77mg/L,加热橙汁为13.23mg/L,相比贮藏0d时分别提高了101.23%㊁128.42%㊂贮藏20d之后呈明显下降趋势,至第70天时,未加热橙汁和加热橙汁相比第0天时,分别降低了65.66%㊁48.33%㊂未加热和加热处理的橙汁中诺米林含量也表现出先上升后降低的趋势,在脐橙贮藏第20天达到最高,未加热橙汁的诺米A-柠檬苦素;B-诺米林图1㊀不同采收期脐橙制备橙汁中柠檬苦素和诺米林含量的变化Fig.1㊀The change of limonin and nomilin during differentharvest periods注:不同小写字母表示不同采收期脐橙制备橙汁加热处理和未处理的10个样品之间的柠檬苦素和诺米林含量差异显著(P<0.05)林含量为0.88mg/L,加热橙汁为1.13mg/L,相比贮藏0d时分别提高了86.73%㊁117.45%㊂值得注意的,当脐橙贮藏40d及后续贮藏过程中,在未加热和加热处理的橙汁中均未检出诺米林㊂与刘萍等[28]在对不同贮藏条件对沙田柚苦味物质含量变化的趋势类似,不论是常温还是4ħ贮藏条件下,在果实汁胞中的苦味物质的含量均呈现先上升后下降的趋势,且常温条件下柠檬苦素含量上升时间较4ħ贮藏的提前㊂可能是在一定的贮藏期内,果实的抗逆性增强或者是部分柠檬苦素的配糖体在酶的作用下降解成苷元,从而导致柠檬苦素表现出先升高的趋势[29]㊂随着后续冷藏的进行,在游离单糖作为底物的条件下,柠檬苦素苷元又被柠檬苦素葡萄糖基转移酶转化成糖苷,导致后降低的趋势[30]㊂而刘珞忆等[31]研究的奉节脐橙果实的柠檬苦素含量在低温贮藏0~30d呈先上升后下降,贮藏30d 后逐渐上升趋势㊂丁帆等[32]在研究贮藏温度对温州蜜柑柠檬苦素含量变化中,显示在贮藏后期柠檬苦素含量在贮藏0~40d内呈先上升后下降,贮藏40d后逐渐上升趋势,与本试验研究结果不一致㊂但类似的是,其在贮藏0~20d时,柠檬苦素含量显著上升,与本试验贮藏前期相吻合㊂由此推测,在本试验脐橙贮藏10~30d 之间,是苦味物质受低温影响的敏感时期,与袁奇等[33]的结论相符㊂A -柠檬苦素;B -诺米林图2㊀不同贮藏期脐橙制备的橙汁中柠檬苦素及诺米林含量的变化Fig.2㊀The change of limonin and nomilin during differentstorage periods注:不同小写字母表示不同贮藏期脐橙制备的橙汁的16个样品之间柠檬苦素和诺米林含量差异显著(P <0.05)2.3㊀加工单元操作对橙汁中苦味物质含量的影响由图3㊁表1可知,采用破碎工艺制备的橙汁中的柠檬苦素和诺米林均显著高于采用挤压工艺制备的橙汁,过滤使橙汁中柠檬苦素含量略微上升,但无显著性差异㊂酶解后橙汁中的柠檬苦素含量显著升高(P <0.05),采用挤压工艺和破碎工艺制备的橙汁中的柠檬苦素含量相对酶解前分别增加了3.28㊁4.02mg /L㊂而2种取汁工艺的橙汁中的诺米林在酶解处理后以及后续单元操作,均未被检出㊂胶体磨处理,使破碎汁略微下降(P >0.05),却使挤压汁显著上升,至接近破碎汁柠檬苦素含量㊂均质和浓缩复原处理对前一操作单元橙汁均无显著影响㊂结果表明,在本试验加工操作单元中,取汁方法和酶解是影响橙汁苦味物质含量的主要单元㊂在取汁过程中,破碎取汁工艺将囊衣打碎,使其与橙汁充分混合,同时较挤压取汁工艺获得的橙汁更浓稠㊂柠檬苦素难溶于水,但果汁中的果胶会增加柠檬苦素和诺米林的溶解度[34],从而导致破碎取汁工艺制备橙汁的苦味物质含量比挤压取汁工艺制备的橙汁更高㊂酶解过后,橙汁未检出诺米林,可能因为在长时间热处理后诺米林自身降解以及转化为诺米林酸等其他类柠檬苦素㊂而柠檬苦素在酶解后显著上升,在胶体磨㊁均质处理后略微降低,在加工过程中柠檬苦素含量的降低原因可能是单元操作会导致类柠檬苦素结构改变以及活性的损失,影响柠檬苦素稳定性的主要原因有pH 值㊁热处理温度㊁与空气接触时间等[35],同时BARTON 等[36]研究发现,在70ħ下热处理5h,柠檬苦素会被水解成为类柠檬苦素苷元和葡萄糖㊂而在酶解过程中柠檬苦素含量的上升,是柠檬苦素生成量大于损失量导致㊂但在该过程中柠檬苦素前体㊁柠檬苦素和柠檬苦素糖苷之间的具体转化情况尚不清楚,需进一步研究柠檬苦素㊁诺米林在该过程中的转化及产物的变化情况㊂图3㊀橙汁加工过程中柠檬苦素含量的变化Fig.3㊀The change of limonin content in orangejuice processing注:不同小写字母表示不同加工操作单元挤压汁㊁破碎汁的12个样品柠檬苦素含量差异显著(P <0.05)表1㊀橙汁加工过程中诺米林含量的变化单位:mg /L Table 1㊀The change of nomilin content in orangejuice processing单元挤压汁㊁破碎汁的12个样品诺米林含量差异显著(P <0.05)2.4㊀pH 值及温度对热处理橙汁中苦味物质含量的影响由图4可知,在相同的处理温度时,随着加热时间的增加,橙汁中柠檬苦素和诺米林的含量均增加㊂在相同的加热时间时,随着处理温度的增加,橙汁中的柠檬苦素和诺米林的含量也随着增加㊂冯桂仁等[37]对胡柚汁进行热处理的柠檬苦素的变化规律也显示类似的趋势㊂而热处理对果汁中诺米林含量的变化却鲜有研究㊂50ħ热处理时,随着加热时间的延长,橙汁中的柠檬苦素含量增加速率较慢,30min后,柠檬苦素含量为1.41mg/L㊂同时60㊁70㊁80㊁90㊁100ħ热处理下橙汁的柠檬苦素含量明显高于50ħ热处理下的橙汁㊂热处理过程中诺米林含量变化规律与柠檬苦素类似,但90㊁100ħ热处理下橙汁的诺米林含量明显高于50㊁60㊁70㊁80ħ热处理下的橙汁㊂由表2㊁表3可知,固定橙汁的pH值时,随着加热时间的延长,橙汁中的柠檬苦素和诺米林含量均呈增加的趋势㊂另外,本次研究表明酸性条件下会极大促进热处理过程中橙汁柠檬苦素和诺米林的生成, pH=3.0时,在初始5min,柠檬苦素与诺米林的含量分别达到了3.96㊁10.14mg/L,当pHȡ6.0时,橙汁在30min的热处理时间内柠檬苦素含量低至无法检出;而pHȡ5.0时,诺米林已经无法检出㊂此次研究结果表明热处理过程中,处理温度㊁时间㊁pH值是影响橙汁柠檬苦素和诺米林含量的主要因素㊂酸性条件和加热条件是使橙汁 后苦味 增加更快的主要原因[13,37]㊂本次试验结果表明,在酸性环境下,橙汁中的柠檬苦素和诺米林产生速率更快,而当pH值逐渐上升至中性时,橙汁中柠檬苦素和诺米林相继无法被检出㊂这可能是因为pH值逐渐升高的过程中,柠檬苦素前体物质转化为柠檬苦素的效率逐渐降低㊂MAIER等[38]指出LARL和柠檬苦素之间的转化是D环的开环和闭环,且该反应是可逆的,当pH<6.0时,柠檬苦素-D-环内酯水解酶促进无苦味的LARL反应生成有苦味的柠檬苦素㊂当pH>8.0时,柠檬苦素即会被水解成LARL㊂因此柠檬苦素-D-环内酯水解酶的活性决定了橙汁中的柠檬苦素的含量,当控制橙汁体系中的pH值时,在一定程度上可以调控橙汁中的柠檬苦素含量㊂本次试验时,当调节橙汁的6.0ɤpHɤ8.0时,在初始过程柠檬苦素-D-环内酯水解酶可能是未参与D环闭合反应或活性较低,从而导致在热处理30min内,均未检测到柠檬苦素的生成㊂但目前柠檬苦素-D-环内酯水解酶的结构与酶反应动力学均未缺乏系统的研究,且酶活性的检测也缺乏相应的方法,后续将开展热处理过程中pH 值㊁温度及时间等参数对柠檬苦素D环内酯水解酶活性的影响㊂综合热处理结果推测,促进LARL转化成柠檬苦素的酶可能具有较好的耐热性,又或者该转化过程并非酶促反应,而酸性环境是柠檬苦素D环闭合的最主要原因㊂A-柠檬苦素;B-诺米林图4㊀不同温度热处理过程橙汁中柠檬苦素和诺米林含量的变化Fig.4㊀The change of limonin and nomilin content of orangejuice during heat treatment at different temperatures 表2㊀不同pH热处理过程橙汁中柠檬苦素含量的变化单位:mg/L Table2㊀The change of limonin content of orange juice during heat treatment at different pH处理pH=3.0pH=4.0pH=5.0pH=6.0pH=7.0 5min 3.96ʃ0.11b3.76ʃ0.09c1.26ʃ0.59d// 10min4.07ʃ0.38b3.88ʃ0.21bc1.42ʃ0.42cd// 15min4.13ʃ0.47b3.98ʃ0.06b1.68ʃ0.39bcd// 20min4.33ʃ0.30ab3.98ʃ0.03b1.99ʃ0.18abc// 25min4.59ʃ0.55ab4.52ʃ0.01a2.24ʃ0.05ab// 30min4.93ʃ0.05a4.62ʃ0.11a2.48ʃ0.35a//㊀㊀注: / 表示含量低于检测限;不同小写字母表示相同pH值不同热处理时间的6个样品之间的柠檬苦素含量差异显著(P<0.05)(下同)表3㊀不同pH值热处理过程橙汁中诺米林含量的变化单位:mg/L Table3㊀The change of nomilin content of orange juice during heat treatment at different pH处理pH=3.0pH=4.0pH=5.0pH=6.0pH=7.0 5min10.14ʃ0.01a2.59ʃ0.65a/// 10min10.22ʃ0.45a2.65ʃ0.19a/// 15min10.46ʃ0.10a3.13ʃ0.14a/// 20min10.49ʃ0.69a3.14ʃ0.63a/// 25min10.57ʃ0.50a3.33ʃ0.19a/// 30min10.63ʃ0.05a3.35ʃ0.10a///2.5㊀橙汁热处理过程中苦味物质含量变化规律的动力学研究橙汁在热处理过程中苦味物质含量变化与很多因素有关,目前变化机理还没有被阐述清楚,而动力学模型是变化规律和基础反应理论相结合的,能够阐述食品组分在贮藏加工过程中的变化过程,同时也能通过动力学模型拟合对食品贮藏加工过程中组分含量变化定量描述[39]㊂前人已经对食品贮藏加工过程中不同处理对水分[40]㊁V C[41]㊁多酚[42]等组分变化的动力学模型展开了系统深入的研究,但对橙汁中苦味物质的变化缺乏研究㊂由表4㊁表5可知,在50㊁60㊁70㊁80㊁90及100ħ的热处理过程中,橙汁柠檬苦素含量的变化与联合反应模型的拟合度更高,回归系数R2最大,分别为0.999㊁0.974㊁0.988㊁0.962㊁0.967㊁0.977㊂类似的是,在50㊁60㊁70㊁80㊁90及100ħ的热处理过程中,橙汁诺米林含量的变化也和联合反应模型的拟合度更高㊂结果表明,可用联合反应模型拟合不同温度热处理下橙汁中柠檬苦素和诺米林含量随着加热时间的变化㊂表4㊀不同温度热处理时橙汁中柠檬苦素变化规律的动力学参数Table4㊀Values of the heat treatment constant and coefficient of the model for limonin in orange juice underdifferent temperatures柠檬苦素反应模型温度/ħ反应常数R250C0=0.899k0=0.0150.87460C0=1.695k0=0.0760.963零级反应70C0=1.856k0=0.0740.982 (C=C0+k0t)80C0=2.070k0=0.0770.92590C0=2.780k0=0.0630.934100C0=2.893k0=0.0980.96550C0=0.914k1=0.0130.90760C0=1.923k1=0.0250.940一级反应70C0=2.066k1=0.0230.960 (C=C0e k1t)80C0=2.295k1=0.0220.89090C0=0.139k1=0.0020.912100C0=3.148k1=0.0210.94350C0=1.006k0=-0.091k1=-0.0930.999联合反应60C0=1.541k0=0.125k1=0.0160.974 [C=k0/k1-(k0/k170C0=1.729k0=0.118k1=0.0140.988 -C0)e(-k1t)]80C0=1.607k0=0.225k1=0.0430.96290C0=2.400k0=0.232k1=0.0430.967100C0=2.659k0=0.185k1=0.0190.977由表6㊁表7可知,在调节pH值为3.0㊁4.0㊁5.0的橙汁在热处理过程中,橙汁柠檬苦素含量的变化与联合反应模型的拟合度更高,回归系数R2最大,分别为0.998㊁0.916㊁0.996㊂且在调节pH值为3.0㊁4.0的橙汁在热处理过程中,橙汁诺米林含量的变化也和联合反应模型的拟合度更高,其R2分别为0.961㊁0.921㊂结果表明可用联合反应模型拟合不同pH值橙汁在热处理过程中柠檬苦素和诺米林含量随着加热时间的变化㊂表5㊀不同温度热处理时橙汁中诺米林变化规律的动力学参数Table5㊀Values of the heat treatment constant andcoefficient of the model for nomilin in orange juiceunder different temperatures诺米林反应模型温度/ħ反应常数R250C0=0.899k0=0.0150.87450C0=1.217k0=0.0220.97260C0=1.156k0=0.0340.987零级70C0=1.600k0=0.0260.969 (C=C0+k0t)80C0=1.941k0=0.0250.84090C0=2.795k0=0.0460.959100C0=3.094k0=0.0410.92250C0=1.255k1=0.0130.95460C0=1.229k1=0.0190.987一级反应70C0=1.639k1=0.0130.965 (C=C0e k1t)80C0=1.964k1=0.0110.85890C0=2.869k1=0.0130.944100C0=3.152k1=0.0110.90950C0=1.109k0=0.080k1=0.0370.994联合反应60C0=1.192k0=0.017k1=-0.0090.991 [C=k0/k1-(k0/k170C0=1.596k0=0.029k1=0.0010.975 -C0)e(-k1t)]80C0=2.120k0=-0.187k1=-0.0900.93490C0=2.550k0=0.187k1=0.0390.984100C0=2.838k0=0.211k1=0.0440.956表6㊀不同pH值热处理时橙汁中柠檬苦素变化规律的动力学参数Table6㊀Values of the heat treatment constant andcoefficient of the model for limonin in orange juiceunder different pH柠檬苦素反应模型pH值反应常数R2零级反应3.0C0=3.669k0=0.0380.929(C=C0+k0t)4.0C0=3.502k0=0.0350.8665.0C0=0.955k0=0.0510.994一级反应3.0C0=3.697k1=0.0090.944(C=C0e k1t)4.0C0=3.528k1=0.0090.8795.0C0=1.109k1=0.0270.991联合反应3.0C0=3.908k0=-0.287k1=-0.0760.998 [C=k0/k1-(k0/k14.0C0=3.697k0=-0.223k1=-0.0630.916 -C0)e(-k1t)]5.0C0=1.009k0=0.033k1=-0.0100.9963㊀结论脐橙的采收贮藏期㊁橙汁的加工单元操作均对橙汁中柠檬苦素与诺米林的含量影响较大,考虑到橙汁的口感,在保证其他营养品质在可接受范围内,可以延后采收时间和采用贮藏30d后的脐橙进行橙汁的制备㊂在加工过程中,应从取汁方法㊁热处理参数等来控制橙汁的苦味物质含量,可以采用挤压取汁和低温灭菌,如超高压灭菌等㊂表7㊀不同pH值热处理时橙汁中诺米林变化规律的动力学参数Table7㊀Values of the heat treatment constant and coefficient of the model for nomilin in orange juice under different pH诺米林反应模型pH 值反应常数R2零级 3.0C0=10.066k0=0.0200.929(C=C0+k0t)4.0C0=2.450k0=0.0330.887一级反应3.0C0=10.072k1=0.0020.927(C=C0e k1t)4.0C0=2.501k1=0.0110.871联合反应[C=k0/k1-(k0/k13.0C0=9.919k0=0.539k1=0.0500.961 -C0)e(-k1t)]4.0C0=2.206k0=0.186k1=0.0500.921橙汁pH值和热处理的温度对橙汁中苦味物质影响较大,且在100ħ下仍能促进橙汁中柠檬苦素和诺米林含量的增加㊂随着pH值的升高,橙汁中苦味物质逐渐降低,当pH值>6.0时柠檬苦素和诺米林均未检出㊂综合来看,柠檬苦素-D-环内酯水解酶具有较好的耐热性,又或者LARL转化成柠檬苦素的反应只是和酸碱性有关,并非酶促反应㊂综上所述,在实际橙汁生产加工过程中,可参考以上结论并根据实际生产需求确定合适的脐橙加工原料和生产工艺,以降低橙汁的苦感至消费者可接受范围内㊂参考文献[1]㊀XU L,XU Z,WANG X,et al.The application of pseudotargetedmetabolomics method for fruit juices discrimination[J].Food Chem-istry,2020,316:126278.[2]㊀方修贵,戚行江,胡安生.柑橘果实中抗癌活性物质的研究现状和前景[J].食品与发酵工业,2003,33(10):79-82.FANG X G,QI X J,HU A S.Current studies and prospect on active substance of anticancer effect in citrus fruit[J].Food and Fermenta-tion Industries,2003,33(10):79-82.[3]㊀张元梅,周志钦.柑橘生物活性物质及其心血管疾病防治作用研究进展[J].中药材,2011,34(11):1799-1804.ZHANG Y M,ZHOU Z Q.Current Studies on bioactive substances in citrus and the preventive and therapeutic effects on cardiovascular diseases[J].Journal of Chinese Medicinal Materials,2011,34(11):1799-1804.[4]㊀刘堂发.赣南脐橙品牌竞争力提升研究[D].南昌:南昌大学,2014:1-2.LIU T F.Study on enhancing brand competitiveness of gannan navelorange[D].Nanchang:Nanchang University,2014:1-2. [5]㊀MAIER V P,BEVERLY G D.Limonin monolactone,the nonbitterprecursor responsible for delayed bitterness in certain citrus juices [J].Journal of Food Science,1968,33(5):488-492. [6]㊀MAIER V P,HASEGAWA S,HERA E.Limonin D-ring-lactonehydrolase.A new enzyme from citrus seeds[J].Phytochemistry, 1969,8(2):405-407.[7]㊀RAITHORE S,DEA S,MCCOLLUM G,et al.Development of de-layed bitterness and effect of harvest date in stored juice from two complex citrus hybrids[J].Journal of the Science of Food and Agri-culture,2016,96(2):422-429.[8]㊀FAN S,ZHANG C,LUO T,et al.Limonin:A review of its pharma-cology,toxicity,and pharmacokinetics[J].Molecules,2019,24(20):3679.[9]㊀ZHAO P,DUAN L,GUO L,et al.Chemical and biological compar-ison of the fruit extracts of Citrus wilsonii Tanaka and Citrus medica L[J].Food Chemistry,2015,173:54-60.[10]㊀YANG Y,WANG X,ZHU Q,et al.Synthesis and pharmacologicalevaluation of novel limonin derivatives as anti-inflammatory and an-algesic agents with high water solubility[J].Bioorganic&Medici-nal Chemistry Letters,2014,24(7):1851-1855. [11]㊀DA SILVA S A V,CLEMENTE A,ROCHA J,et al.Anti-inflam-matory effect of limonin from cyclodextrin(un)processed orangejuices in in vivo acute inflammation and chronic rheumatoid arthritismodels[J].Journal of Functional Foods,2018,49:146-153.[12]㊀刘韬,乔宁,饶敏,等.基于色谱质谱联用技术分析纽荷尔脐橙果汁及其果酒的香气成分和苦味物质[J].食品工业科技,2018,39(4):244-249.LIU T,QIAO N,RAO M,et al.Analysis of aroma components andbitter substances in Newhall navel orange juice and wine by chro-matography-mass spectrometry[J].Science and Technology ofFood Industry,2018,39(4):244-249.[13]㊀左安连,毛海舫,李琼,等.柑橘类果汁脱苦方法研究综述[J].香料香精化妆品,2008(3):33-39.ZUO A L,MAO H F,LI Q,et al.A review on research of the re-moval of bitterness in citrus juices[J].Flavour Fragrance Cosmet-ics,2008(3):33-39.[14]㊀毕静莹.柑橘酒苦味物质及其控制技术研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2019:43-44.BI J Y.Study on the bitter substances and its control technology ofcitrus wine[D].Yangling:College of Enology Northwest A&F Uni-versity,2019:43-44.[15]㊀刘棠,杨远帆,杜希萍,等.柚苷酶处理㊁果汁浓缩和低温贮藏对柚子果汁中柠檬苦素的影响[J].食品科学,2015,36(4):1-5.LIU T,YANG Y F,DU X P,et al.Effects of Naringinase treat-ment,juice condensation and low-temperature storage on limonin inpummelo juice[J].Food Science,2015,36(4):1-5. [16]㊀王松林,彭荣,崔榕,等.类柠檬苦素生物转化与脱苦研究进展[J].食品科学,2015,36(9):279-283.WANG S L,PENG R,CUI R,et al.Biotransformation and debit-tering of limonoids:An overview[J].Food Science,2015,36(9):279-283.[17]㊀BALA A,KAUSHAL B,JOSHI V,et parison of juice ex-traction methods,determination of bittering principles and stand-ardization of debittering of lime juice[J].Indian Journal of NaturalProducts and Resources(IJNPR)[Formerly Natural Product Radi-。